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基因工程的酶學基礎(chǔ)-powerpoint演示文稿(編輯修改稿)

2026-01-25 17:43 本頁面

　

【文章內(nèi)容簡介】的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個連接位點中載體 DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去 5’ P的鏈不能進行連接，形成 3’ OH 和 5’ OH 的缺口。平末端 DNA片斷的連接 1. T4DNA連接酶 2. 用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用 DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法同聚物加尾法用 5’ 末端特異的核酸外切酶處理 DNA片斷在 A和 B分別中加入 dATP和 dTTP 同聚物尾巴 10~40個堿基同聚物加尾法或 T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，獲得插入片斷進行進一步的研究。銜接物連接法平末端的另一種處理方式是利用銜接物（ linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子 DNA，約 10~20個核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的回文結(jié)構(gòu)。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 將銜接物分子與平末端 DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。 Hpa II Hpa II BamH I 或 Sau3A 銜接物（ linker）是指用化學方法合成的一段由 10～ 12個核苷酸組成、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙銜接物：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比較方便。銜接物連接法雙銜接物連接法的基本程序 cDNA鏈的合成通過 DNA聚合酶合成第二鏈加入 Sal I銜接物 S I核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由 Klenow補齊，加入第二銜接物 Ecol I 在用 DNA銜接物連接法時，如果待克隆 DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆的基因切斷。 DNA接頭（ adapter）連接法： 1978年，美國康奈爾大學生化分子生物學系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對 DNA接頭分子末端，進行必要的修飾。移走粘性末端 5’ P，暴露出 5’ OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。 DNA接頭連接法熱穩(wěn)定的連接從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。 1. 寡核苷酸連接測定 2. （ oligonucletide ligation assay,OLA） 3. 用兩個寡核苷酸探針，同已知序列的靶 DNA雜交，探針在靶 DNA分子的位置是相鄰的。 2. 連接酶鏈式反應（ lingase chain reaction,LCR）；也叫連接擴增反應（ lingase amplication reaction） 3. 用寡核苷酸探針通過 DNA連接酶的作用擴增已知序列的靶 DNA的方法。需要 4種引物，寡核苷酸連接測定 AGTGACCT TCACTGGA A G T G A C C T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A G T G A C C T A C C T A G T G A C C T A C C T 待擴增的 DNA片斷 P P B B D D 地高辛配基生物素磷酸 B B B B D D P P 陽性信號無信號酶抗生素蛋白由于堿基錯配不能形成磷酸二酯鍵檢測單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性 LCR： ligase chain reaction，連接酶鏈式反應。樣品 DNA、探針 (4) 94度變性 DNA聚合酶常用的 DNA聚合酶：大腸桿菌 DNA聚合酶、大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 Klenow大片斷酶、 T4DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶等。共同點：把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的 3’ OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。大腸桿菌 DNA聚合酶 DNA聚合酶Ｉ（ PolＩ）、 DNA聚合酶 ?（ Pol ? ）、 DNA聚合酶 ? （ Pol ? ）、 PolＩ和 Pol ? 的主要功能參與 DNA的合成； Pol ? 的功能同 DNA的復制有關(guān)； PolＩ同 DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ： 1957年，美國的生物學家次證實，在大腸桿菌提取物中存在一種 DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的 DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為 109?1000dal。 DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個片斷，一個具有全部的 3

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