幾丁質(zhì)對海洋生防酵母抑菌活性的影響及相關(guān)機理的研究畢業(yè)論文(編輯修改稿)

　

【文章內(nèi)容簡介】 和苯菌靈（ Benomyl）等被美國環(huán)保機構(gòu)所禁用，并部分或全部的自動退出采后應(yīng)用市場。 此外由于長期使用殺菌劑，病原菌進化 并 產(chǎn)生了大量抗藥性菌種。 因此，找到一種新的安全的可以替代化學殺菌劑，控制果蔬采后病害的新方法具有非常重要的意義。 果實采后病害 物理 防治 果蔬采后病害防治物理方法主要有：熱處理；低溫冷藏 ； 微波處理；氣調(diào)；輻射處理；低壓處理。低溫冷藏技術(shù)已經(jīng)在部分地區(qū)得到實際運用，熱殺菌和輻照殺菌也是目前報道比較多的方法。 低溫冷藏是一種常用的 保鮮技術(shù)。近幾年來，低溫冷藏技術(shù)又有新的發(fā)展，采用臨界點低溫高濕存儲，即控制在物料冷害點溫度以上 ℃ ～ 1℃ 和相對濕度為 90％～ 98％的環(huán)境中存儲保鮮果蔬。果蔬果實在不發(fā)生冷害的前提下，采用盡可能低的溫度可以有效地控制果蔬果實在貨架期內(nèi)的呼吸強度，使某些容易腐爛的果實處于休眠狀態(tài)；其次采取相對高濕的環(huán)境可有效降低果蔬水分蒸發(fā)而減少失重（劉憶冬等， 20xx）。冷 藏 技術(shù)最大的局限性在于低溫只能抑制病原菌，不能根除，而且一些熱帶、亞熱帶果蔬果實在低溫下冷害情況嚴重（任紅等， 20xx） 。 由于低溫貯藏、輻照處理和 熱處理等物理方法都需要特定的設(shè)備，這些方法在執(zhí)行起來受到成本、產(chǎn)地、運輸條件等限制。目前，在經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)，低溫貯藏鏈結(jié)合化學殺菌劑是比較成熟的商業(yè)采后處理技術(shù)。 哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第一章 文獻綜述 4 果實采后 病害 生物防治 從可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，開發(fā)新型、高效且安全的有機、綠色的保鮮劑具有重大的社會意義和廣闊的應(yīng)用前景。例如在美國，有機產(chǎn)品的產(chǎn)值已從 1997 年的 億美元增長到了 20xx 年 145 億美元（ Prange et al., 20xx）。利用安全且有拮抗病原菌活性的微生物進行生物防治的方法近 10 年來已經(jīng)取得了突破性的進展， 被認為是最有希望替代化學殺菌劑的方法之一（ Janisiewicz 和 Korsten,20xx） 。 目前已經(jīng)有 4 個基于拮抗微生物的生物防腐劑產(chǎn)品： Aspire（基于拮抗酵母 Candida oleophila，美國）， Yield Plus（基于拮抗酵母 Cryptococcus albidus， 南非）， BioSave 10LP（基于拮抗細菌 Pseudomonas syringae strain，美國）和 Avogreen（基于拮抗細菌 Bacillus subtilis，南非）（ Janisiewicz 和Korsten， 20xx； Fravel， 20xx）。利用拮抗酵母進行水果采后病害的生物防治具有許多其他方法無法比擬的優(yōu)點：如遺傳穩(wěn)定，抑菌譜廣，效價高；一般不產(chǎn)生對人和寄主有害的代謝產(chǎn)物，安全性高；對營養(yǎng)要求低，生長快；對多種脅迫、逆境具有較強的耐受力，對大多數(shù)殺菌劑不敏感，能與多種化學和物理方法相容等（ Janisiewicz 和 Korsten, 20xx； Spadaro 和 Gullino, 20xx）。它 對于保護生態(tài)環(huán)境、減少食品農(nóng)藥殘留、保障公眾健康具有重要意義， 因此 成為當前國內(nèi)外的研究熱點 。 采后拮抗酵母作用機 制 根據(jù)已有的研究結(jié)果顯示，微生物對病原菌有直接作用和間接作用兩種方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，間接作用包括營養(yǎng)和空間的競爭，胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生和誘導(dǎo)抗性等。生防通常是一個以上的機制共同作用的結(jié)果。 營養(yǎng)和空間的競爭 為了抑制病原菌的侵染 , 拮抗菌必須在病原菌到達以前或到達以后的很短時間內(nèi)在果實表面侵染部位占據(jù)優(yōu)勢。 拮抗菌與病原菌爭奪的營養(yǎng)物質(zhì)主要是碳水化合物、氮源等。 Filonow（ 1998） 用 14C 標記的果糖、葡萄糖、蔗糖檢驗在蘋果傷口處的拮抗菌羅倫隱球酵母（ C. laurentii）、擲抱酵母（ S. roseus）與病原菌灰葡萄孢孢子在營養(yǎng)利用上的差別，發(fā)現(xiàn)拮抗菌攝取和利用 14C 果糖的量越大，對分生孢子萌發(fā)的抑制作用越強，說明營養(yǎng)競爭是重要的生防機制。在對 E. herbicola B66和 B90 抑制蘋果青霉病和灰霉病 的研究中發(fā)現(xiàn) ，在稀釋的蘋果汁中， B66 和B90 能抑制灰葡萄孢和擴展青霉分生孢子的萌發(fā)并溶解其萌發(fā)管（ Sobiczewski et al, 1996） ，但 在未稀釋的蘋果汁里這些反應(yīng)并不明顯，說明營養(yǎng)競爭在這里起到了非常重要的作用。在國內(nèi)，范青等的研究也發(fā)現(xiàn)將季哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第一章 文獻綜述 5 也蒙 畢赤 酵母 （ P. guilliermondii） 接種到桃果實的傷口上，在有病菌存在時該拮抗酵母菌的數(shù)量一天內(nèi)可以猛增 200 多倍，這種高速的繁殖活動反映出拮抗菌與病原 菌 之間的營養(yǎng)競爭。 Janisiewicz 等（ 1992）報道在蘋果等果實傷口處，糖類營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，而作為氮源的氨基酸等則相對貧乏，成為競爭的焦點，通過向蘋果傷口加入拮抗菌容易利用而病原菌難以利用的 L天冬氨酸和 L脯氨酸能顯著提高拮抗效果。此外，酵母分泌的胞外多糖也能促進果實表面的粘結(jié)作用從而在空間競爭上占據(jù)優(yōu)勢 (Andrews et al., 1994)。 已有的研究結(jié)果顯示，生防菌在果實傷口處接種越早，其對果蔬采后病原菌的抑制效果越好（ ChandGoyal and Spotts, 1997。 Fan and Tian, 20xx） 。這也反映了營養(yǎng)與空間的競爭可能是海洋酵母抑制致病原菌的重要機理之一。 營養(yǎng)和空間的競爭還被認為對病原真菌的次級代謝有作用（ Bjornberg and Schnurer, 1993。 ChandGoyal and Spotts, 1996）。環(huán)境營養(yǎng)對病原菌的次級代謝，包括真菌毒素的產(chǎn)生具有重要影響（ Luchese and Harrigan, 1996）。這可能是一些酵母拮抗菌能在體外試驗中抑制霉菌菌絲生長的原因之一。比如Petersson和 Schnurer（ 1995） 發(fā)現(xiàn) P. anomala能在體外試驗中減少 P. roquefortii和 亮白曲霉 (Aspergillums candidus)的數(shù)量。 重寄生作用 許多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶（幾丁酶， β1,3葡聚糖酶等），從而分解病原菌的細胞壁或菌絲體。 Gravese 等（ 1998）報道 P. anomala K 對抑制蘋果灰霉病非常有效，因為灰葡萄孢細胞壁能誘 導(dǎo) 其在 蘋果傷口上 分泌的胞外 β1,3葡聚糖酶的量增加 3 倍。出芽短梗霉 （ A. pullulans） 能顯著抑制蘋果等水果采后多種病原菌， Castoria R 和 Ippolito A 等 （ 20xx） 在出芽短梗霉 （ A. pullulans） 處理過的蘋果傷口上檢測到了濃度更高的 β1,3葡聚糖酶和幾丁酶活性。拮抗菌的快速定植和水果本身酶的誘導(dǎo)作用可能導(dǎo)致了胞外溶解酶的 數(shù)量增加。但需要進一步研究這些酶的來源及其在生物防治中的作用。 某些酵母菌還可以附著在病原菌上，形成對病原菌的直接寄生作用。Arras（ 1996） 用電鏡 觀察到拮抗菌無名假絲酵母 (C. famata)可以在病菌菌絲上定植，并促使菌絲裂解。 EIGhaouth（ 20xx） 發(fā)現(xiàn)拮抗菌 C. saitoana 在蘋果傷口處可以緊緊吸附在灰葡萄孢的菌絲上。這些吸附現(xiàn)象不能完全說明在拮抗菌與病原菌之間有重寄生作用，但可以肯定這種現(xiàn)象與拮抗菌的生理活動緊密聯(lián)系，因為經(jīng)過熱殺死的拮抗菌不再有吸附現(xiàn)象發(fā)生。 胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生 一些研究結(jié)果顯示，拮抗菌與病原菌互作時 , 在果實傷口部位生長的酵母細胞外圍有大量的新生物質(zhì)。這些胞外活性物質(zhì)可能參與了拮抗菌與病原哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第一章 文獻綜述 6 菌之間的相互 作用（表 ）。 表 主要產(chǎn)胞外物質(zhì)菌株 誘導(dǎo)抗性 近 5 年來，拮抗 菌 誘導(dǎo)采后果實抗性 成為了生物防治的研 究熱點 。已有的大量 研究表明 ， 多種 生防 菌，包括出芽短梗霉 （ A. pullulans） 、 C. saitoana、C. oleophila、膜醭畢赤酵母 （ P. membranefaciens） 和羅倫隱球酵母 （ C. laurentii）等均 能誘導(dǎo)多種果實的抗性及抗性相關(guān)反應(yīng) ，提高果實自身抗性，減少采后腐爛 （表 ） （ Filonow, 1999, 20xx。 Ippolito et al., 20xx） 。 生防菌作為 激發(fā)子 ， 具有生物可降解和性價比高等優(yōu)良特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。 抗生作用 通過拮抗菌產(chǎn) 生抗生素抑制病原菌作用是人們最早發(fā)現(xiàn)的一種拮抗機理，也是大多數(shù)拮抗細菌最主要的機制之一（表 ）（ Janisiewicz and Roitman, 1988。 Janisiewicz et al., 1991）。但是，在體外試驗中能產(chǎn)生抗生素的菌株中很大一部分不能在體內(nèi)試驗中產(chǎn)生抑菌效果，這是由兩方面的原因造成的：有些細菌只能在“ in vitro”環(huán)境中產(chǎn)生抗生素，而在“ in vivo”則不產(chǎn)生抗菌素；一些細菌不適應(yīng)寄主傷口的環(huán)境，不能存活或生命力下降，因此不能產(chǎn)生很好的拮抗效果。而且能在寄主上保持拮抗能 力的細菌仍具有兩個弊病：首先，抗生素有可能誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗性，從而逐步降低拮抗菌對病害的控制效果；其次，拮抗菌產(chǎn)生的抗生素對食用者也可能產(chǎn)生不利影響。因此進入 20 世紀 90 年代以后，拮抗菌的研究重點逐步從拮抗細菌轉(zhuǎn)向了拮抗酵母。 抗生素名稱 產(chǎn)生菌株 針對 病原菌 蒿屬香豆素、東莨菪亭 無名假絲酵母 (C. famata) 指狀青霉 毒性蛋白 (killer protein) 畢赤酵母屬 (Pichia sp.) 抗細菌物質(zhì) 羅倫隱球酵母 （ C. laurentii） 熒光假單胞菌、 Staphylococcus aureus 揮發(fā)性物質(zhì) 乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis) 擴展青霉 哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第一章 文獻綜述 7 表 采后拮抗 菌 對果實抗性的誘導(dǎo)及對抗性相關(guān)反應(yīng)的刺激 果實 拮抗菌 備注 蘋果 出芽短梗霉 C. saitoana 刺激果實幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和 POD 誘導(dǎo)抗性，并刺激果實幾丁質(zhì)酶、 ?1,3葡聚糖酶 分泌 ?1,3葡聚糖酶 柚子 柑橘 C. oleophila 誘導(dǎo)抗性，并刺激果實乙烯、 PAL, 幾丁質(zhì)酶、 ?1,3葡聚糖酶、積累植保素等 刺激果實硫還原蛋白基因表達 刺激幾丁質(zhì)酶 cDNA 的表達 刺激 ?1,3內(nèi)葡聚糖酶基因表達 草莓 出芽短梗霉 誘導(dǎo)抗性 櫻桃 番茄 膜 醭畢赤酵母 刺激果實 POD，降低 CAT 和 SOD，提高總蛋白，增強 33和 47kDa 蛋白 刺激果實幾丁質(zhì)酶、 ?1,3葡聚糖酶 桃 、梨、棗、蘋果 羅倫隱球酵母 誘導(dǎo)果實抗性；刺激果實幾丁質(zhì)酶、 ?1,3葡聚糖酶、 POD和 PAL 活性 刺激果實 ?1， 3葡聚糖酶基 因表達 表 主要產(chǎn)抗生素菌株 抗生素名稱 產(chǎn)生菌株 作用對象 病原菌 伊枯草菌素 枯草芽孢桿菌 B3 核果類水果 M. fructicola 吡咯菌素 洋蔥假單胞菌 (P. cepacia) LT412W 梨果 、柑橘 核果類水果 擴展青霉、灰葡萄 孢 丁香霉素 E 丁香假單胞桿菌 ESC10 和 ESC11（ BioSave） 檸檬 吡喃酮 木霉 草莓、蘋果 灰葡萄孢 拮抗菌生理調(diào)控及機理的研究 近年來，隨著拮抗菌和病原菌之間 的 細胞學、生物化學和分子生物學研究的不斷深入發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn) 通過調(diào)節(jié)采后拮抗酵母的生理代謝機制可能是增強其拮抗能力的有效途徑之一（ Janisiewicz 和 Korsten, 20xx） 。根據(jù)有限的已發(fā)表資料，關(guān)于采后拮抗菌生理調(diào)控及機理的研究可概括為以下三個方面： 逆境培養(yǎng) Teixid243。等（ 1998）研究表明通過低水分活度培養(yǎng) Candida sake 后其在采前使用時生長數(shù)量明顯增加并增強了酵母的拮抗效力，其機理與積累糖醇和海藻糖有關(guān)； Bonaterra 等 （ 20xx） 報道在培養(yǎng)基中添加 NaCl 后能提高 P. agglomerans EPS125 在不同濕度貯藏 條件下的生防效力，作用 機 制 也 與拮抗哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第一章 文獻綜述 8 菌體內(nèi)海藻糖等物質(zhì)的積累有關(guān)。西班牙 XaRTApostharvest 實驗室 的 研究者發(fā)現(xiàn) 經(jīng) 鹽脅迫誘導(dǎo)培養(yǎng)的 P. agglomerans CPA2 在 冷凍干燥或噴霧干燥后，細胞的存活率比未經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌株有顯著的提高， 且 凍干粉單獨使用或結(jié)合佐劑 Fungicover 使用，對果實病害的抑制效果均顯著高于未經(jīng)脅迫的新鮮酵母 。 拮抗 物質(zhì)的