霉菌毒素總結(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 的污染，致使農產品安全衛生問題嚴重，品種下降，并頻繁危及人類身體健康。生物農藥有以下幾個優點:能有效的控制害蟲，不殺傷天敵，不破壞生態平衡，不污染環境，因而有廣闊的開發前景。目前從霉菌著手尋找生物農藥的研究也很深入廣泛，例如：木霉菌是一類具有廣譜性、拮抗性生物防治菌。食品及化妝品生產領域中都離不開色素，但多使用化學合成色素，其毒性問題已逐步引起人們的關注，國內外在其用量及使用范圍方面均有限制。從生物中提取的天然食用色素無毒性，食用安全性好，但大多數因原料來源少，價格高限制了其廣泛應用。目前用霉菌生產色素的例子也很多，例如:紅曲霉菌，是用于提取色素最多的霉菌，中國利用紅曲已有上千年的歷史，用于紅腐乳、酒類和其他食品中。在霉菌發酵產物中還發現有能抑制缺氧信號傳遞的小分子物質，很多類型的人類腫瘤細胞都處在嚴重缺氧的狀態下，它們為了生存，建立了一系列的級聯反應來緩解缺氧。Pladienolides是一類由普拉特鏈霉菌 Mer2 11107發酵產生的大環內酯類抗生素，可抑制腫瘤細胞生長和缺氧信號傳遞，它在小鼠異種皮移植入腫瘤的模型中表現出了強大的抗腫瘤效果。可見它有望成為新型的抗腫瘤藥物。木霉菌能產生纖維素酶，它可直接作用于纖維素使其斷裂分解為低分子的化合物及葡萄糖等被動物所利用，另一方面，纖維素酶可使粗纖維素分解從而可使更多的植物細胞內容物分離出來，提高了這些營養物質的消化率。此外，木霉菌還可產生半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、果膠酶，這些酶的共同作用可提高對碳水化合物、蛋白質和礦物質的消化吸收率，促進吸收[1]。腐乳是我國獨特的傳統發酵食品之一，系用豆腐坯經毛霉菌培養釀制而成。毛霉菌種的質量好壞關系到腐乳的形狀、色澤滋味及理化質量，目前經過菌種選育，已獲得一株生長快速、菌絲旺盛、蛋白酶活性強的毛霉菌株，用它制成的接種劑可用于腐乳和臘八生產，其產品質量優良、穩定[2]。此外，常用于腐乳的霉菌還有黑根霉、米曲霉、紅曲霉等[3]。2基因工程用酶學方法，將異源基因與載體DNA在體外進行重組，將形成的重組子DNA導入宿體細胞，使異源基因在宿體細胞中復制表達，從而達到改造生物品種或性狀，大量生產出人類所需要的生物品種和產物。[4]：（1）采用cDNA文庫人工合成或PCR擴增，分離制取目的基因片段（2）采用核酸限制性內切酶Ⅱ同時剪切目的基因和克隆載體（3）在T1DNA連接酶的作用下將目的基因與基因載體連接而成重組DNA（4）把重組DNA分子導入受體細胞，并在一起擴增而成克隆子（5）標記分析和篩選出獲得重組DNA分子的克隆受體細胞（6）進一步了擴增、轉化、表達，最終生成新的優良性狀的菌種或人類所需要的產品酶在基因工程操作中是不可缺少的工具，在基因工程中應用的酶統稱為工具酶。要取得所需的目的基因DNA并與載體DNA連接在一起形成DNA重組體，首先要提供限制性內切酶和DNA連接酶。此外，還有其他工具酶，如T1多聚核苷酸激酶、堿性磷酸酯酶、核酸酶S反向轉錄酶和末端脫氧核苷酸轉移酶等。到目前為止，常用的工具酶已有3000多種。目前，在基因工程中應用的基因載體主要是質粒、病毒和噬菌體。載體的具備以下幾個性能：（1）分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。（2）能獨立于染色體而進行自主復制并且是高效的復制。（3）要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點。（4）有適合的標記，易于選擇。（5）有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，并且盡可能是高效的表達。（6）從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉移，僅限于在某些實驗室內特殊菌種內才可復制等等。3霉菌的基因工程改良 用限制性內切酶消化含有目的基因的外源，使其獲得目的基因,并使之產生粘性或平頭末端 ,以與載體連接。限制酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型,常用的為Ⅱ型酶 ,因為它有特異性識別位點 ,切口有規律 ,只要有鎂離子即可激活,且效率極高。 由于真核生物的基因中含有非編碼間隔區 ,在原核生物中無法正常表達 ,必須除去內含子。mRNA是經轉 錄加工過 的RNA,無內含子 ,在反轉錄酶下,以mRNA為模板合成出互補DNA再加上接頭,即可與載體連接。 PCR擴增技術實際是體外DNA合成放大技術。其基本原理是依據細胞分裂中DNA合成半保留機制，及在體外DNA分子于同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉變的性質 ,人為控制體外合成系統的溫度,使雙鏈變成單鏈。單鏈DNA和人工引物退火。以及在dNTP存在下 ,耐高溫的DNA 聚合酶使引物沿單鏈模板延升雙鏈DNA高溫變性,低溫退火,適溫延升等三步循環使DNA 擴增。 鳥槍法實質上是采用基因工程手段把染色體DNA用限制性內切酶切割，將所有的片段都連接到某種載體上，轉入大腸桿菌中增值。再用適當方法來篩選含該基因的重組體菌落，從重組體細菌提取DNA，經酶切后即可制取該基因。對真核細胞基因，因酶切后形成大小不等的成千上萬DNA片段，若采用此法則難于篩選出所需要的基因。因此，可采用凝膠電泳、密度梯度離心法或液相層析等方法。先把DNA片段按大小分成幾個組，然后，在采用鳥槍法分離目的基因。 載體是用于傳遞外源DNA序列進人宿主細胞,其本身也為DNA分子。合適的載體有如下要求：必須能 自我復制。有可克隆位點 ,供外源DNA插人。有可供選擇的遺傳標記 ,如抗藥性基因、酶基因、營養缺陷型等。載體應盡量小 ,抗剪切力。表達型載體應具備與宿住基因相應的啟動子、增強子、前導序列。常用的載體有：質粒載體、入噬菌體、粘粒、絲狀噬菌體、病毒載體、酵母人工染色體卡粒載體。目的基因的體外重組即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。重組有如下方法：:粘粒末端法 ,且常用雙標記法。平頭末端連接法 ,用T4DNA連接法。人工接頭法,其大小應為8─12bp。用同聚物接尾法 ,常用cDNA法。：當載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。較少的情況下，對產生的平端也可直接進行連接。：即同聚物加尾連接法。當載體和目的基因無法采用同一種限制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，采用此方法。首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的339。端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補進行粘合，再由DNA連接酶連接。：將人工連接器（即一段含有多種限制酶切點的DNA片段）連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。重組子構建后 ,必須送人宿主細胞使之發揮作用 ,常用物理方法、化學方法和生物方法。其一般過程為：（1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。（3）目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內就能獲得大量的目的基因。 該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細胞，把細胞擊孔，使目的基因進入受體。 是利用高壓電脈沖的作用對原生質體或細胞擊出微孔而使基因轉移的一種新方法。，此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后用激光光源代替熒光光源，聚焦后發出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細胞周圍的外源DN