基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)-資料下載頁

　　

【正文】 生物學(xué)活性 編碼的結(jié)構(gòu)基因 ＋ ＋ ＋ － 109 400 ～ 600 1 polyA ＋ ＋ － ＋ 420 1020 ～ 9000 15 polyC（ dnaE， N， Z，X， Q） DNA聚合酶 Ⅰ ? 來源 ， 由染色體 DNA基因編碼 。 商品上用的此酶來源于 Phage NM964整合的溶源性 。 ? 結(jié)構(gòu) 一條多肽鏈 ， MW = 109， 000 D。 ? 活性 5′→ 3′聚合 ， 3′→ 5′和 5′→ 3′外切 。 Klenow ?來源： DNA PolymeraseⅠ 經(jīng)蛋白酶水解的大片段 (Klenow和 ) DNApolⅠ 枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶 C端 (76kd) + N端（ 36kd） 5’→ 3’外切 Klenow 5’→ 3’ 聚合 3’→ 5’ 外切 Klenow ? 用途 ?填補(bǔ)限制酶的 5′ 粘性末端為平齊末端 5’…CC 3’…GGAATT 5’…CCTTAA3’ 3’…GGAATT5’ Klenow ?3′ 末端標(biāo)記： Klenow 在無底物時(shí)只進(jìn)行 3′ → 5′ 外切；有底物存在時(shí)則聚合 。 這種標(biāo)記也稱作交換標(biāo)記 ， 但 Klenow作用不如T4DNA聚合酶 。 T4DNA ? 來源： T4Phage感染的 ? 結(jié)構(gòu)： MW=114， 000d ? 活性： 5′ → 3′ 聚合活性； 3′ → 5′ 外切活性 ， 對(duì)單鏈活性大于雙鏈 DNA，外切酶活性比 Klenow大 200倍 ? 用途 ?填補(bǔ)或標(biāo)記限制酶切后產(chǎn)生的 5′ 粘性末端的3′ 凹缺末端 。 （ 同 Klenow） ?3′ 粘性末端的標(biāo)記制備 DNA探針 ,同 Klenow 末端標(biāo)記 。 T7DNA聚合酶（測(cè)序酶） ?來源： T7Phage感染的 ?結(jié)構(gòu)：由 2個(gè)蛋白亞基組成： T7phage gene5蛋白 + 宿主硫氧蛋白 ?活性： ?5′ → 3′ 聚合 ， 持續(xù)反應(yīng)時(shí)間最長 ， 所以合成的 DNA鏈長 。 故在 DNA測(cè)序中很優(yōu)越 。 ?3′ → 5′ 外切 ， 是 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 1000倍 。 ?用途 ?復(fù)制較長的模板，在測(cè)序中可讀出較長的序列 ?用填補(bǔ)或交換反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記。 ?與 T４ DNApol一樣，平齊粘性末端。 ?定點(diǎn)突變中互補(bǔ)鏈的合成。 5′ 3′ 3′ 5′ 修飾的 T7DNA 聚合酶 (測(cè)序酶 ) ? 來源： 天然 T７ DNA聚合酶經(jīng)修飾處理 ? 結(jié)構(gòu)：同 T７ 聚合酶 。 用還原劑 、 分子氧 、 低濃度 Fe２ +與酶保溫幾天 ，可使 PhageT7 gene5蛋白 N端 3′ → 5′ 外切酶活性中心失活 (O 修飾 )。 即： 5′ → 3′ 聚合酶作用提高 ， 持續(xù)性長 。 3′ → 5′ 外切作用下降 99%以上 。 Taq DNA 聚合酶 (Thermusaqraticus) ? 來源：從耐熱細(xì)胞中純化，已有基因工程酶多種 ? 結(jié)構(gòu)：?jiǎn)蝸喕?MW=94000d。 ? 活性：聚合最適溫度為 7580℃ ， 不具 3′ → 5′外切酶活性 ， 具 5′ → 3′ 外切活性 。 ? 用途： ?PCR反應(yīng)。 ?測(cè)序， 高溫 下進(jìn)行 DNA合成可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)。 ? DNA聚合酶 Ｉ缺陷的突變株仍能生存，表明DNA聚合酶Ｉ不是復(fù)制的主要酶。 ? 1970年， DNA聚合酶 Ⅱ ，分子量 120KDa。 ? 特點(diǎn)： ? 5’ → 3’的聚合酶活性；作用于雙鏈 DNA分子中有空隙（ gap）的單鏈， gap不長于 100個(gè)核苷酸 ? 3’ → 5’的外切酶活性 ? 無 5’ → 3’的外切酶活性； DNA聚合酶 Ⅱ ? DNA聚合酶 Ⅲ 是細(xì)胞內(nèi) DNA復(fù)制的所必需的酶。 ? DNA聚合酶 Ⅲ 由多個(gè)亞基組成（ αεζδβ） ? 特點(diǎn)： ? 5’ → 3’的聚合酶活性；作用于雙鏈 DNA分子中有空隙（ gap）的單鏈 ? 3’ → 5’的外切酶活性 ? 5’ → 3’的外切酶活性； DNA聚合酶 Ⅲ 反轉(zhuǎn)錄酶（ reverse transcriptase） ?來源 ：商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種 ?來自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒 (AMV)。 ?來自能表達(dá) Moloney鼠白血病毒 (MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶基因的 。 ?結(jié)構(gòu)和活性 ： 酶類別 肽鏈 5’3’聚合活性 RNAseH AMV α 62， 000 β 94， 000 + +++ MMLV 84， 000 + + ?用途： (1) 5’ 3’ 聚合酶活性 , 能以 RNA或 DNA模板合成 DNA分子； (2) RNA酶 H活性 ， 對(duì) RNA:DNA雜交體中的 RNA特異性地降解 ， 免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用 NaOH降解 RNA模板的步驟 。 (3)用于３ ’ 凹陷末端的標(biāo)記 ， 雜交探針的制備和DNA序列測(cè)定 ． cDNA的合成主要步驟： 在某種生物的 mRNA分子中 ， 加入引物使之與 mRNA退火 ， 并引導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄酶按照 mRNA模板合成第一鏈cDNA， 產(chǎn)物是 mRNA:DNA雜交分子；然后再以 cDNA第一鏈為模板合成 cDNA． ? 磷酸激酶催化 5’OH 加 P （標(biāo)記） ? 和磷酸酶去除 5’ P （防止自身環(huán)化） PNKase PMase 5′HO A T T A G C ??? C C G T A A T C G ??? G G C OH 5′ 多核苷酸激酶 磷酸甲酯酶 Phosphomonoesterase 5′p A T T A G C ??? C C G T A A T C G ??? G G C p 5′ 磷酸激酶和磷酸酶 重組 DNA技術(shù)中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列，切割 DNA DNA連接酶 催化 DNA中相鄰的 5180。磷酸基和 3180。羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使 DNA切口封合或使兩個(gè) DNA分子或片段連接 DNA聚合酶 Ⅰ ① 合成雙鏈 cDNA分子或片段連接 ② 缺口平移制作高比活探針 ③ DNA序列分析 ④ 填補(bǔ) 3180。末端 Klenow片段 又名 DNA聚合酶 I大片段，具有完整 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合、 3??5?外切活性，而無 5??3?外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈 DNA 3?末端標(biāo)記等 反轉(zhuǎn)錄酶 ① 合成 cDNA ② 替代 DNA聚合酶 I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或 DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5180。羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶 在 3180。羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 重組 DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 小 結(jié) 分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體 接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體菌 篩 篩選重組體 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 目 錄 ? 1 概念 ? 限制酶、 DNA連接酶、識(shí)別位點(diǎn)、粘性末端、平末端、同尾酶、同裂酶、 缺口nick、裂口 gap、 銜接物、人工接頭 ? 2限制酶 Ⅱ 的基本特征。 ? 3DNA分子的體外連接方法有哪些。