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【正文】 是證明在 突變株 中有 失活酶 的存在 。 主要實驗方法有： 免疫血清反應 ★ 免疫血清反應 :一種酶的免疫血清能和該酶蛋白發生沉淀反應使之失去酶活性 。 ★ 在缺陷型 突變株 中某一種酶的活性消失了 ， 可是 一級結構略有改變的這種酶蛋白 ， 也會與該酶的免疫血清反應而測得它的存在 。 ★ 這種失去酶活性但仍保存了免疫血清學特性的物質稱為 交叉反應物質 （ CRM） 。 ★ 證明失活酶存在的 實驗過程： ① 試管滴定法： 用野生型菌株的酶注射家兔，取得它的抗酶抗血清 在突變株酶抽提物中加入抗血清 反應后離心去除沉淀物 在上清液中加入野生型代謝酶 若不產生或只有很少沉淀產生，說明突變株中有與酶蛋白結構相似的CRM。 ?② 培養皿測定法 ： 野生酶 抗酶抗血清 2,3,4,5,6突變型抽提物 如果突變株抽提物中有 CRM存在，也會產生相同的沉淀帶 . 抗血清將在瓊脂中擴散 ??? 在抗血清和酶接觸的地方形成肉眼可見的白色沉淀帶 ??? (一 )驗證 “一個基因一種酶 ”假說 證明了結構基因的作用 在研究中首先發現 ： ? 同一營養缺陷型是由幾個非等位基因突變產生的 ? 或者：引起相同突變的基因并不是等位的 該假說在研究 粗糙脈孢菌營養缺陷型突變中提出的 營養缺陷與遺傳代謝性障礙的關系 這一現象通過 來解釋 1 營養缺陷與遺傳代謝性障礙的關系 x??? A??? B??? C??? D 氨基酸 D營養缺陷突變型 甲 乙 丙 丁 ★ 氨基酸 D由一系列的遺傳代謝產生的 ★ 任何一步 遺傳代謝性障礙會產生氨基酸 D營養缺陷突變型 ★ 任何一步 遺傳代謝由基因控制，因此基因突變可導致遺傳代謝性障礙 ★ 在實驗中 ,通過添加中間產物 ,突變株可以恢復正常生長 ? 同一營養缺陷型是由幾個非等位基因突變產生的 營養缺陷與遺傳代謝性障礙的關系 這一現象通過 被證實 互養現象 被證實 這一現象通過 2 互養實驗 不同氨基酸 D缺陷型可以通過互養實驗來區別 互養實驗同樣可以證明基因的等位性 ① ② ③ 3 “一個基因一種酶 ” 假說的驗證 ? 假說 :每一個基因控制一種酶的一級結構 ? 基因突變使酶的一級結構改變，從而使酶的活性喪失。 ? 驗證假說 :證明在突變株中有失活酶的存在 ? 驗證方法 :免疫血清反應 ① 試管滴定法 ： 用野生型菌株的酶注射家兔，取得它的抗酶抗血清 在突變株酶抽提物中加入抗血清 反應后離心去除沉淀物 在上清液中加入野生型代謝酶 若不產生或只有很少沉淀產生，說明突變株中有與酶蛋白結構相似的 CRM。 基因突變導致酶失活 , 基因控制酶的一級結構 ?② 培養皿測定法 ： 野生酶 抗酶抗血清 2,3,4,5,6突變型抽提物 也證明了突變株里有失活酶的存在 第 二節、順反子和互補群 互補測驗和順反子 互補作用 ： 是使二個突變型的染色體同處于一個細胞內 ， 在不發生基因重組的條件下 ， 由于相應突變型基因的相互補償而使細胞表型正常化的作用 。 互補作用在實質上是兩個突變基因在同一細胞內的互養作用 。 ? 互補測驗的基本要求： ? 不發生基因重組。 ? 凡是符合這一要求的二倍體、 異核體 ，或者是感染了兩個突變型噬菌體的寄主細菌都可以用作互補作用的測驗系統。 1）異核體形成測驗 ? 將兩個營養缺陷或其它突變型的分生孢子 混合接種在基本培養基上 ，若能培養（基本培養基 )獲得異核體菌株）， 則表明供試突變型的兩個基因在功能上不相同，屬子非等位基因。 ?反之，如果不能形成異核體菌株，原因有兩個： ? 供試突變型的兩個基因 屬于等位基因，不能夠互補。 ?還可能來自于兩個突變株之間的不親和性，即兩個菌絲體之間不能經質配而形成異核體。 ? 例：已知某一真菌的精氨酸突變株A1和 A2不能在基本培養基上形成異核體 ? 經過誘變從 A1中篩選獲得抗鏈霉素突變株 Smr A1，從 A2中篩選獲得抗卡那霉素突變株 Kmr A2 ? kmr 和 smr 為非等位基因 。 Smr A1孢子 Kmr A2孢子 Sm＋ Km＋ A平板 不能得到異核體 突變株 A1和 A2不親合 能得到異核體 在 Sm＋ Km＋ 平板上不能得到 異核體 A1和 A2是等位基因突變 ★ 異核體形成測驗 和 互養測驗 都是基因互補性測驗 。 ? 其差異主要在于：互養測驗時兩個突變株之間通過培養基相互提供自身不能合成的代謝產物 （ 分泌到細胞外 ） ， ? 異核體形成測驗中兩個突變基因在同一細胞內相互提供 基因轉錄翻譯的產物或酶 。 2）順反位置效應測驗 ★ 比較結構基因的順式和反式結構表型效應的互補測驗稱為順反位置效應測驗 。 ★ 基因位點：同一個基因的各個突變型結構發生變化的位置 。 ★ 一個基因座位內可以有多個位點 ， 在發揮作用上仍屬于統一的整體 ， 一個座位是一個功能單位 ， 稱它為順反子 （ cistron） 。 ★ 當一個座位中的兩個突變位點排列在一條染色體上 ， 而兩個野生型位點排列在另一條同源染色體上相對位置上時 ， 這種排列稱為順式 （ cis） , ★ 當一個座位中的兩個突變位點分別排列在同源兩條染色體上時 ， 這種排列稱為反式 （ trans） (圖 ) 順式 反式 ?順反位置效應測驗 ★ 用大腸桿菌噬菌體 T4的快速溶菌突變株 （ r） 分別感染 B、 S和 K等三個不同的大腸桿菌菌株 ， 可以進一步區分出 rI、 rII和 rⅢ 等三種類型（ 表 ） ★ 各種 rⅡ 突變型組合得到的野生型噬菌體數各不相同。 ★這說明這些突變位點之間的距離不同 。 重組實驗 通過重組實驗可以確定不同缺陷型基因相對位置 重組類型 rⅡ A+/rⅡ B+為野生型 , 可在 K上形成噬菌斑， 重組類型 rⅡ A/rⅡ B為缺陷型 ,不能可在 K上形成噬菌斑。 ★ r47， r106和 r51等表型效應相同的位點是屬于同一個基因 ， 還是不同的基因 ？可以通過互補實驗證明 。 互補實驗確定不同突變位點 是否屬于同一個基因 互補實驗 ★ 將一系列 rⅡ rⅡ rⅡ rⅡ 4兩兩配對 ， 計算兩位點重組頻率 , 確定相對位置 . ★ 把所有的 rⅡ 突變型兩兩互補測驗，得到 A和 B兩大群 ★ 由此可見 ， 在兩個 rⅡ 突變型混合感染時出現的突變型噬菌斑 ， 是由于兩個 rⅡ 突變型具有互補作用； ★ 它們相互滿足在寄主 K中進行復制所需要的因素 ， 從而恢復了復制能力； ★ 在復制過程中發生了基因重組 ,并產生野生型噬菌體 。 互補實驗確定不同突變位點 是否屬于同一個基因 3）雜基因子： 細胞中如某一野生型基因和突變型基因共存 , 即個別基因呈雜合狀態的細胞稱為雜基因子。 ? ★ 例 。利用 λ噬菌體的 λdg和 λdb轉導子感染相應的缺陷型宿主細胞，很容易獲得 雜基因子 。 ★ 將 Gal Gal 和 Gal4等三個半乳糖發酵缺陷型突變株作為受體菌先劃線接種在半乳糖培養基上 。 ★ 分別滴加從 Gal+、 Gal Gal 2和Gal 4獲得的高頻轉導噬菌體 λdg。 ★ 經培養后可以發現：如果 供體菌和受體菌突變基因不同 ， 那么均可出現紅色的轉導子 。 ★ 在 Gal1和 Gal4之間只產生少量延遲出現的紅色小菌落 伊紅美蘭瓊脂培養基（ EMB） 該培養基中添加 半乳糖 為碳源 ,如果大腸桿菌為半乳糖發酵缺陷型 ,則不能生長 ,如果能夠發酵利用半乳糖 ,產酸產氣 , pH變化引起 伊紅美蘭顏色變化 ,形成紅色大菌落 . Gal Gal 和Gal4為半乳糖發酵缺陷型突變株 整片紅色菌落是雜基因子后互補的結果； 延遲出現的少數紅色菌落發生基因重組的結果。 ★ 首先出現的 整片紅色菌落 是供 、 受體菌基因形成 雜基因子后互補 的結果； ★ 延遲出現的少數紅色菌落 是由于雜基因子在繁殖過程中發生 基因重組 的結果 。 ? ? 根據以上實驗結果，可以確定 Gal Gal2和 Gal Gal4屬于不同的順反子 互補作用 ?Gal1和 Gal4屬于同一順反子 重組作用 。 Smr A1孢子 Kmr A2孢子 Sm＋ Km＋ A平板 不能得到異核體 突變株 A1和 A2不親合 能得到異核體 在 Sm＋ Km＋ 平板上不能得到 異核體 A1和 A2是等位基因突變 ① ② kmr 和 smr 為非等位基因。 順式結構 反式結構 2. 基因順反位置效應測驗 研究基因在四種相對位置下的重組和互補作用 (1)重組實驗 確定不同突變基因相對位置 (2)互補實驗 確定不同突變位點是否屬于等位基因 既有互補作用又有重組作用 ：證明了基因互補作用 Gal Gal 和Gal4為半乳糖發酵缺陷型突變株 整片紅色菌落是雜基因子后互補的結果； 延遲出現的少數紅色菌落發生基因重組的結果。 某基因的野生型和突變型共存與同一細胞 雜基因子 野生型和突變型可以互補