分子生物學大題-資料下載頁

　　

【正文】 (β 4)，易被氧化，解聚成游離的單鏈，并積聚成包涵體，附著于紅細胞膜并使之受損，失去柔韌性，易被脾臟破壞，導致中度或較嚴重的溶血性貧血，稱為血紅蛋白 H病 ( Hb H disease )。（C）輕型(標準型) a 地中海貧血：基因型：a a/ (a0地貧雜合子)或 a / a (a+地貧純合子)。缺失2個 a 基因，間或有輕度貧血，我國主要是a 0地貧雜合子。輕型a地貧患者之間婚配，生育子女中患 Hb Bart’s胎兒水腫綜合征的機率為1/4。（D）.靜止型 a地中海貧血：基因型：a / a a ( a + 地貧雜合子 )，僅缺失1個a 基因，無癥狀。靜止型 a 地貧與輕型 a 地貧個體婚配，可有1/4機會生育Hb H病患兒。：1）Southern印跡雜交及限制性酶譜分析法：A）.α和ζ珠蛋白基因探針制備；B）內切酶譜結果鑒定。 2）PCR方法：設計3條引物進行雙重PCR擴增，A）若擴增出AB的314bp片段，而不能擴增出AC片段，則為正常；B）若擴增出AB的314bp片段,且能擴增出一條500600bp的片段(縮短了的AC),則為a地1；C）若只能擴增一條500600bp的片段，但不能擴增出AB的314bp片段,則為Bart’s水腫胎。：目的基因的選擇與制備224。受體細胞的培養224。載體的選擇224。目的基因導入靶細胞224。轉導細胞的篩選和鑒定224。基因治療的安全性監測和療效評價.(方法)的選擇：1）直接法(體內法) ( in vivo )：特點：直接向體內某組織(器官)轉基因。優點：操作簡便；缺點：基因轉移和表達的效率都較低。 2） 間接法(回輸法) ( ex vivo )或稱離體法。特點：離體培養細胞，轉基因后回輸至患者體內。優點：成功率相對較高；缺點：操作繁瑣。目前此類方法常用。3）原位法 ( in situ )直接向患者的病變部位轉基因。：1）目標基因導入靶細胞的方法分為兩類：病毒學方法和非病毒學方法。2）病毒學方法： 是指以重組病毒為載體，通過感染將目的基因導入靶細胞的方法。：1）逆轉錄病毒科是RNA病毒。具有二倍體基因，RV可將其基因組整合到感染細胞的DNA上。基因組分為3個區：第1個區為LTR(含增強子、啟動子、轉錄起始和終止信號)；第2個區為ψ序列 (其編碼產物能有效包裝病毒基因組進入病毒顆粒)；第3個區含3個結構基因(gag、pol、env)。 能有效轉錄的真核DNA序列連鎖時, 就能獲得有效表達, 從而產生新霉素磷酸轉移酶使G418失活。顯然, 當真核細胞轉入neo基因后，就會在含G418的選擇性培養基中存活，而未轉入neo基因的細胞則不能生存。：1）基因置換(基因矯正)：有兩種含義:其一,指將致病基因整個地以正常基因置換，使致病基因永久性得到更正；其二，指對缺陷基因的異常序列進行精確的原位修復但不影響鄰近的基因。基因定點突變、定點敲除和定點修復均屬于基因打靶(gene targeting)技術。2）基因添加：在不去除異常基因的前提下， 將目的基因導入病變細胞或其他細胞(非定點整合)，以目的基因的表達產物來補償缺陷基因的功能或使原來的功能得到加強。3）基因干預 是指采用特定的手段，抑制或阻斷某個基因的表達。 基因干預的靶基因：過度表達的癌基因、病毒復制周期的關鍵基因。技術方法：反義核酸技術；反義核酸核酶技術；細胞內抗體( intrabody )技術 等等。(ribozyme)技術：核酶催化部份和底物部份組成錘頭結構。1）能進行分子內自我催化的RNA片段不很長，通常為60個核苷酸左右。2）同一分子上包括有催化部份和底物部份。3）核酶催化作用的特點：A)都有一個活性中心，催化時形成中間復合物，具有比蛋白質酶更高的底物特異性；B)核酶對底物的切點處序列普遍為含GU序列。(ADA)缺陷病的基因治療：1），基因全長32kb， mRNA長1 530bp。2）ADA缺陷導致SCID的分子機制：ADA或PNP缺失導致dATP或dGTP在細胞內積蓄，對早期T、B細胞發育有毒性作用，使之停滯于proT/proB階段，引起嚴重聯合型免疫缺陷（SCID）.3）基因治療研究：ADAgene + vector （逆轉錄病毒）224。重組分子224。導入生長、分裂的細胞224。ADA gene表達224。回輸患兒體內224。 1~2月治療一次, %。:1）抑制和殺傷腫瘤細胞：；；；。2）腫瘤細胞的基因“修飾”。3）調節和增強機體的免疫功能。十一、生物芯片 ：1）易尋址，利用組合化學的原理安排各寡核苷酸的位點，芯片反應后易尋址；2）點位牢固，用表面化學方法處理基片，使核苷酸固定在基片上；3）定點合成，光導向平板印刷技術，芯片表面可用屏蔽物屏蔽，光照選擇性脫保護，有利于定點合成寡核苷酸中的各個堿基；目前技術可達的集成度：10萬40萬點陣/cm2，探針長度8nt20nt。4）受專利保護。：(1).制作方式：(前者為別處合成和收集探針，后固化；后者是原位化學合成；(2).探針類型：(前者可用常規分子生物學方法合成的任一種探針,后者為化學合成寡核苷酸)；(3).探針長度：(前者為后者的十倍到幾十倍)；(4).探針集成度：(前者低，后者高)；(5).技術保密性(只有后者受專利保護)。:(1)探針的設計與芯片的制作：設計，制備，玻片的多聚L賴氨酸預處理，探針的打印與固化。(2)待測樣品核酸的提取、擴增與標記：探針不標記，而待測核酸(液相)標記。(3)．雜交反應與雜交后清洗:芯片雜交與常規分子雜交相似。(4)掃描與圖像分析，數據的標準化處理與分析。 (5)結果與討論：(一)顯微光蝕刻技術：經化學處理,支持物表面活性羥基(OH) 連接光敏保護基(X) 選用光刻掩模(M1)保護非聚合部位224。用激光點光源照射聚合部位,以去除光敏保護基(X),露活性羥基(OH)224。 加入單核苷酸(如dTMP)的亞磷酰胺活化端與活性羥基(OH)發 生化學偶聯 ,光敏保護非活化端224。更換另一掩模(M2)，激光點光源照射下一個位點224。脫保護，偶聯第二個核苷酸(如dCMP)224。重復上述步驟，直至合成完所需探針. (二)壓電打印法. (三)分子印章法: 寡核苷酸合成試劑224。分子印章(涂布)224。 壓印獲得芯片(特定位點)224。 合成反應. :1）芯片的雜交類型：固液相雜交(固相：探針；液相：靶分子核酸)。2）芯片雜交的特點：探針的數量靶基因的數量。3）雜交反應動力學：呈線性關系。4）雜交信號強度∝ (樣品)靶基因的量。5）空間位阻效應：探針224。 靶分子；探針224。探針。6）雜交反應條件與反應條件的優化。：1)完全互補性：對靶序列 的保守區而言；2)高度特異性：對基因家族的某個成員或對不同 生物 種屬的同一基因而言；3)探針的豐度：針對靶基因序列設計多個(3個以上)寡核苷酸探針；4)設計單堿基錯配即MM(mismatch)探針：作內參照(衡量探針的特異性)。：注意事項：1）不同來源的樣品分別用不同顏色的熒光素標記(Cy3為紅色,標記處理組；Cy5為綠色,標記對照組)，以便比較分析；） 2）對同一種dNTP，既要加入熒光標記的，也要加入非標記的(如Cy3dCTP與dCTP)，并調整兩者的比例，使雜交信號最強。 討論：若用Cy3dCTP或Cy5dCTP(分別標記2種樣品)，則應相應調整其余3種dNTP的濃度。 后續步驟： 終止反應224。降解模板(總RNA或mRNA ) 224。過柱(濾去游離的熒光核苷酸)224。洗脫、濃縮 、真空干燥224。溶解樣品。：1） 溫度；2）探針堿基組成及其濃度；3）靶核酸長度、堿基組成及其濃度；4）雜交液的組成。：1）疾病診斷所依據的標志性蛋白質分子；2）對藥物的療效、毒副作用作出評價；3）尋找藥物作用的靶蛋白。十二、細胞內信號轉導通路：：① 通過相鄰細胞直接接觸（直接通訊）：A）.間隙連由連接蛋白形成,允許小分子和離子通過；B）.細胞表面分子 互相識別、粘附介導的通訊；C）.突觸連接 介導的通訊(神經系統)；② 通過細胞分泌各種化學物質調節其他細胞的代謝和功能（間接通訊)：內分泌信號；旁分泌信號；自分泌信號。：特定的細胞釋放信息物質224。擴散或血循環到達靶細胞224。與靶細胞的受體特異性結合224。受體對信號進行轉換并啟動細胞內信使系統224。靶細胞產生生物學效應。3. cAMP 蛋白激酶Ａ途徑：組成：胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環化酶 (adpenylate cyclase，AC)， cAMP，蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)4. PKA：1）由四個亞基組成：R2C2 （R調節亞基，C催化亞基）；2）被cAMP激活： 3）催化多種蛋白質絲/蘇氨酸磷酸化。：1）由兩個相同亞基組成；2）被cGMP激活；信號通路：3）ANP,NO,細菌內毒素等→作用于具有GC活性的受體→GC激活→cGMP↑→PKG活性↑→蛋白磷酸化→生理效應：1）與病毒癌基因 vakt編碼的蛋白Akt同源，又稱為Akt；2）為單鏈結構，有三種亞型；3）可與PIP3結合而間接被激活；4）與細胞代謝、凋亡、癌變有關。：1）受Ca2+ 和二酰基甘油（DAG）激活；2）參與細胞多項生理活動。 （MAPK）：1）MAPK是蛋白激酶家族,包括ERK,JNK和p38MAPK三個亞家族；2）激活級聯反應：MAPKKK(Raf) →MAPKK(MEK) →MAPK(ERK) →生理作用。3）MAPK是多條信號通路的交匯點,與調節細胞生長、分化、凋亡有關。（PTK or TPK）：1）此類激酶促進蛋白質中酪氨酸的磷酸化。2）分為兩大類:受體型PTK—許多生長因子受體；非受體型PTK,如src,abl,FAK。3）PTK與細胞生長、增殖、癌變有關。4）PTK抑制劑中可篩選抗癌藥。：1）G蛋白是多種膜受體傳入信號的“開關”。2）異三聚體G protein由三個亞基α,β,γ組成。巳知17種α亞基,5種β亞基,7種γ亞基,故G蛋白是一個大家族。3）α亞基可結合GTP或GDP,并有GTP酶活性,αGTP可活化下游信號分子,βγ亞基是調節亞基。：1）分子量2萬3萬的單鏈結構，功能類似異三聚體G protein的α亞基，可結合GTP或GDP,并有GTP酶活性；2）最重要的是癌基因Ras和 Rho亞家族；3）RasGTP代表“開”,RasGDP代表“關”.控制信號轉導。：1）是一個大家族,分為兩大類：蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶。2）其作用與蛋白激酶相反，）抑癌基因產物PTEN是一種磷酸酶，可使PIP3脫磷酸化為PIP2，也可催化蛋白質中磷酸酪氨酸或絲/蘇氨酸脫磷酸(PLC) ：PIP2＋H2O－→IP3＋ DAG(PIK) ：不同的kinase 利用ATP催化PI逐級磷酸化 PI→PI4P→PI(4,5)P2 → PI(3,4,5)P3。 Kinase：1）被許多GF及Oncogene激活；2）催化：PI ——PI3P。 PI4P———PI（4）P2。 PI（5）P2———PI（5）P3 。3）PI（5）P3似與細胞生長、分裂、癌變、運動有關(NOS) ：L精氨酸＋2NADPH＋2O2→L瓜氨酸＋NO+2H2O：1）膜受體：存在于細胞質膜上的受體，絕大部分是鑲嵌糖蛋白。根據其結構和轉換信號的方式又分為三大類：離子通道受體，G蛋白偶聯受體和單跨膜受體。2）胞內受體：位于細胞漿和細胞核中的受體，全部為DNA結合蛋白。受體的結構：高度可變區，DNA結合區，激素結合區，鉸鏈區。：1）高度專一性；2）高度親和力；3）可飽和性；4）可逆性；5）特定的作用模式。：1）磷酸化與脫磷酸化作用；2）膜磷脂的代謝的影響；3）酶促水解作用；4）Ｇ蛋白的調節。 蛋白激酶Ａ途徑：1）組成: 胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環化酶AC)， cAMP，蛋白激酶 A(PKA)。 2）信息傳遞：激素224。受體224。Ｇ蛋白224。酶224。第二信使224。蛋白激酶224。酶或其他功能蛋白224。生物學效應. 3）生理意義：通過對效應蛋白的磷酸化作用，實現其調節功能，如促進蛋白質合成、改變膜對水及離子通道的通透性、影響細胞分泌、加強心肌收縮。+－依賴性蛋白激酶途徑：1）Ca2+－ 磷脂依賴性蛋白激酶途徑組成:胞外信息分子，G蛋白，磷脂酶C (PLC)，甘油二酯 (DAG)，三磷酸肌醇(IP3 )，蛋白激酶C (PKC)。 2）Ca2+－ CaM激酶途徑組成:受體、G蛋白、PLC、IPCa2+、鈣調蛋白、CaM激酶。 3）PKC的生理功能：① 調節代謝活化的PKC引起一系列靶蛋白的絲 、蘇氨酸殘基磷酸化。② 調節基因表達。對膜離子轉運功能、機體代謝、基因表達、細胞分化和增殖等的調節起作用。：1）組成:受體，鳥苷酸環化酶(GC)，cGMP, 蛋白激酶G (PKG)。2）生理效應：PKG使有關蛋白或酶類的絲、蘇氨酸殘基磷酸化，如心鈉素、NO舒張血管平滑肌。利尿和舒張血管的作用。：1）受體型TPKRasMAPK途徑組成：催化性受體，GRB2, SOS, Ras蛋白, Raf蛋白，MAPK系統。2）JAKsSTAT途徑(多種細胞因子的信號轉導通路)組成:非催化性受體，JAKs (janus kinases)，信號轉導子和轉錄激動子 (STAT)。3）TPK在細胞的生長、增殖、分化等過程起重要的調節作用，并與腫瘤的發生有密切的關系。：1) TNF――――― Cer 等激酶系統――――――激活NF kB病毒感染、脂多糖、活性氧中間體、佛波酯、雙鏈RNA等 2)生理意義：主要涉及機體防御反應、組織損傷和應激、細胞分化和凋亡，以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞。:1) SMAD最早被證實的TβRⅠ激酶的底物,可將其歸結成三大類：受體調節的SMADs (R SMADs), 共同的偶配體SMADs (CoSMADs), 抑制性SMADs (