微生物學實驗指導大全-資料下載頁

　　

【正文】 孢子呈綠色，子囊為粉紅色。注意觀察子囊孢子的數目、形狀和子囊的形成率。(4)計算子囊形成的百分率：計數時隨機取3個視野，分別計數產子囊孢子的子囊數和不產孢子的細胞，然后按下列公式計算：子囊形成率（%）=3個視野中形成子囊的總數247。3個視野中（形成子囊的總數+不產孢子細胞總數）100%5．酵母菌假菌絲的觀察 取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培養基中，取出放在溫室培養的支架上，待培養基凝固后，進行酵母菌劃線接種，然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上(圖12—1)，28℃培養2～3d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養基，在顯微鏡下直接觀察。可見到芽殖酵母形成的藕節狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節狀假菌絲(圖12—2)。圖12—1 酵母菌假菌絲的培養 圖12—2 酵母菌的假菌絲形態 A. 藕節狀假菌絲； 6．自然狀態下的酵母菌觀察 取一滴美藍染色液于載玻片中央，春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜湯上的白膜，將其置于載玻片染色液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下仔細觀察酵母菌形態，出芽生殖，假菌絲等。四、注意事項1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養基要新鮮、表面濕潤。2．在產孢培養基上加大移種量，可提高子囊形成率。3．通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞。五、實驗報告(一)繪圖1．數個酵母菌細胞，示觀察到的結構。2．數個子囊及子囊孢子形態圖。(二)記錄并計數酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始記錄及計算結果)。六、問題和思考1．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區別?2．如何區別營養細胞和釋放出的子囊孢子?3．試設計一個從子囊中分離子囊孢子的試驗方案。注：酵母菌的簡易培養 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl調至pH3～5放入幾塊葡萄皮（或其他糖分較高的果皮），置5～28℃溫箱中培養2～3d，聞到酒香味后，即可取培養液鏡檢。實驗13 霉菌的形態觀察一、實驗目的和內容目的：了解霉菌形態，掌握微生物載玻片濕室培養方法。內容：1．霉菌載玻片濕室培養。2．曲霉、青霉、根霉、毛霉形態觀察。3．根霉假根的觀察。二、實驗材料和用具產黃青霉(Penicfillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopus nigrians)、總狀毛霉(Mucor racemosus)等斜面菌種。半固體PDA培養基、乳酸苯酚固定液、棉藍染色液、20%甘油。透明膠帶、剪刀、培養皿、載玻片、口形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環。三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。1．準備濕室 在培養皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“冂”形載玻片擱架，在擱梁上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經12lC濕熱滅菌30min后，置60℃烘箱中烘干，備用。2．接種 用接種環挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時只要將帶菌的接種環在載玻片上輕輕碰幾下即可(務必記住接種的位置)。3．加培養基 用無菌細口滴管吸取少量融化約60℃的培養基，滴加到載玻片的接種處，培養基應滴得圓而薄，(滴加量一般以l/2小滴為宜)。4．加蓋玻片 在培養基未徹底凝固前．用無菌鑷子將皿內蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當接近，但不能壓扁，否則不透氣。5．倒保濕劑 每皿倒大約3mL 20%的無菌甘油，使皿內的濾紙完全潤濕，以保持皿內濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28℃恒溫培養3～5d。(二)黑根霉假根的培養將融化的PDA培養基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的l/2。冷凝后，用接種環沾取根霉孢子，在平板表面劃線接種。然后將平皿倒置，在皿蓋內放一無菌載玻片，于28℃培養2～3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結構（圖13—1）。 圖13—1 根霉假根的培養(三)鏡檢觀察1．濕室培養霉菌鏡檢載玻片 從培養16～20h開始，通過連續觀察，可了解孢子的萌發、菌絲體的生長分化和子實體的形成過程。將濕室內的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態，重點觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點，曲霉的足細胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。繪圖。2．粘片觀察 取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。3．假根觀察 將培養根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調節焦距以看清各種構造。4．制成永久裝片 把觀察到霉菌形態較清晰，完整的片子，制成標本作較長期保存。制備方法是，輕輕揭去蓋玻片，如果載玻片上有瓊脂，仔細挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片四周滴加樹膠封固。四、注意事項載玻片濕室培養時，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分結構平行排列，易于觀察。五、實驗報告(一)繪制鏡檢形態圖1．毛霉和根霉形態圖，示各部。2．青霉和曲霉形態圖，示各部（二）載玻片觀察記錄各菌種的載玻片標本觀察結果：菌種菌絲體（氣生菌絲、營養菌絲的粗細、色澤、菌絲有隔或無隔等）無性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結構（有無假根、足細胞匍匐菌絲、囊軸等）六、問題和思考1．什么叫載玻片濕室培養?它適用于觀察怎樣的微生物，有何優點?2．濕室培養時為何用20%甘油作保濕劑?3．本實驗中觀察假根的設計原理是什么?此設計還適合于培養哪類菌。實驗14 細菌大小的測定一、實驗目的和內容目的：學會測微尺的使用和計算方法及對球菌和桿菌的測量。內容：1. 認識測微尺，學習目鏡測微尺的標定。2．測定金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌體的大小。二、實驗材料和用具金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的玻片標本。香柏油、二甲苯；顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、擦鏡紙。三、操作步驟 l．測微尺的構造 顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接物測微尺組成，目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(圖14一lC)。目鏡測微尺每格實際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數而改變，因此在使用前必須用鏡臺測微尺進行標定。鏡臺測微尺為一專用中央有精確等分線的載玻片(圖14—1A)，一般將長為1mm的直線等分成100個小格，是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。2．目鏡測微尺的標定 把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，并使兩尺左邊的一條線重合，向右尋找另外一條兩尺相重合的直線(圖15—lB)。3．計算方法標定公式：目鏡測微尺每格長度（μm）=兩條重合線間鏡臺測微尺的格數10247。兩條重合線間目鏡測微尺的格數例如，目鏡測微尺20個小格等于鏡臺測微尺3小格，已知鏡臺測微尺每格為10μm，則3小格的長度為310=30μm，那么相應地在目鏡測微尺上每小格長度為310247。20=。用以上計算方法分別校正低倍鏡、高倍鏡及油鏡下目鏡測微尺每格實際長度。4．菌體大小的測定 將鏡臺測微尺取下，分別換上大腸桿菌及金黃色葡萄球菌玻片標本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數，再以目鏡測微尺每格的長度計算出菌體的長和寬。并詳細記錄于表15—1中。例如，目鏡測微尺在這架顯微鏡下，測量的結果，若菌體的平均長度相當于目鏡測微尺的2格，則菌體長應為3=。一般測量菌體的大小，應測定10～20個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。四、注意事項1．鏡臺測微尺的玻片很薄，在標定油鏡頭時，要格外注意，以免壓碎鏡臺測微尺或損壞鏡頭。2．標定目鏡測微尺時要注意準確對正目鏡測微尺與鏡臺測微尺的重合線。五、演示1．目鏡測微尺、鏡臺測微尺的顯微鏡下示教。2．標定及測量方法示范。六、實驗報告1．目鏡測微尺標定結果：低倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 μm。高倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 μm。油鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 μm。2．菌體大小測定結果：菌號大腸桿菌測定結果金黃色葡萄球菌的直徑大小測定結果目鏡測微尺格數實際長度目鏡測微尺格數 實際直徑/181。m寬長寬長12345678910均值試與己知的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的大小作一比較是否一致？為何？七、問題和思考1．為什么更換不同放大倍數的目鏡和物鏡時必須重新用鏡臺測微尺對目鏡微尺進行標定？2．若目鏡不變，目鏡測微尺也不變，只改變物鏡，那么目鏡測微尺每格所測量的鏡臺上的菌體細胞的實際長度（或寬度）是否相同？為什么？實驗15 微生物數量的測定細菌群體生長表現為細胞數目的增加或細胞物質的增加。測定細胞數目的方法有顯微鏡直接計數法(direct microscopic count)、平板菌落計數法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細胞物質的方法有細胞干重的測定，細胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產物的測定等。總之，測定微生物生長量的方法很多，各有優缺點，工作中應根據具體情況要求加以選擇。本實驗主要介紹生產、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法和光電比濁計數法。一 顯微鏡直接計數法（一）目的要求1．明確血細胞計數板計數的原理。2．掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。（二） 基本原理顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板、PeteroffHauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學檢查。顯微鏡直接計數法的優點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結合活菌染色微室培養（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數活菌體的目的。本實驗以血球計數板為例進行顯微鏡直接計數。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。該計數板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數室。血細胞計數板構造如圖l51。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規格的計數板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，(萬分之一毫升)。圖15—1 血細胞計數板構造（一） 圖15—2 血細胞計數板構造（二）A. 正面圖；； 放大后的方格網，中間大方格為計數室；2. 蓋玻片；計數時，通常數五個中方格的總菌數，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數，然后再換算成lml菌液中的總菌數。設五個中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，如果是25個中方格的計數板，則1mL菌液中的總菌數=A/525104B=50000AB（個）同理，如果是16個中方格的計數板，1mL菌液中的總菌數=A/516104B=32000AB（個）（三）器材1．菌種 釀酒酵母2．儀器或其他用具 血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。（四）操作步驟l．菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當的菌懸