微生物學檢驗實驗指導-資料下載頁

　　

【正文】 用鍋內(nèi)余熱烘干水汽，10min后取出滅菌物品。（3）注意事項：1）每次滅菌前應檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態(tài), 尤其是安全閥是否良好。整個過程，必須嚴格按照操作規(guī)程由專人操作，避免意外事故發(fā)生，確保安全。2）無菌包不宜過大，物品不宜放得過滿過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央。3）冷空氣必須排盡，但溫度并沒有達到121℃，影響滅菌效果，達不到徹底滅菌的目的。4）加熱過程中，注意其壓力表指針勿超過警戒線。如果出現(xiàn)這種情況，要及時冷靜地處理，首先應去除熱源（電源），讓壓力緩緩回落。5）滅菌結(jié)束時，不應立即放氣，而應停止加熱使其自然冷卻 20~30min，使鍋內(nèi)壓力下降至零位（壓力表指針回到零位）后數(shù)分鐘，將放汽閥打開，然后略微打開鍋蓋（開一條縫），人離開消毒室，待其自然冷卻到一定程度再將物品取出。6）滅菌器用過之后應及時排除鍋內(nèi)的水，敞開蓋子讓水蒸汽蒸發(fā)，可防止高壓滅菌器生銹。7）定期檢查滅菌效果。檢測方法如下：①化學指示法：利用化學指示劑在一定溫度與作用時間條件下受熱變色或變形的特點，以判斷是否達到滅菌所需溫度。苯甲酸的熔點為121~123℃，滅菌后看到苯甲酸粉末變成液態(tài)，冷卻后成固體，表示已達到滅菌的目的。②留點溫度計法：滅菌后看溫度是否達到滅菌所需溫度。③生物學指示法：是高壓蒸汽滅菌中檢測效果中最可靠的一種方法。通常利用耐熱的非致病性嗜熱脂肪芽孢桿菌作指示菌。將滴加細菌芽胞的紙條、鋁片等載體，放置于滅菌器的不同位置，滅菌后，取出試紙條，接種于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置55～60℃溫箱中培養(yǎng)48h至7天觀察結(jié)果，根據(jù)紙片中芽孢死亡與否來判斷是否達到滅菌要求。若培養(yǎng)后顏色未變，澄清透明，說明芽胞已被殺滅，達到了滅菌要求。若變?yōu)辄S色混濁，說芽胞未被殺滅，滅菌失敗。（4）適用范圍：耐高溫、高壓的物品，如金屬器械、玻璃器皿、生理鹽水、棉纖等的高壓滅菌。5．紫外線消毒試驗 （1）工作原理：細菌的DNA可以吸收紫外線，使一條DNA鏈上的兩個胸腺嘧啶共價結(jié)合形成二聚體，從而干擾DNA的復制與轉(zhuǎn)錄，導致細菌的死亡和變異。波長在200~300nm的紫外線有此殺菌作用，其中以265~266殺菌作用為最強。（2）試驗方法：1）取A、B、C 3個普通平板，分別將葡萄球菌劃線接種于平板上。2）然后用鑷子將無菌紙片貼在A平板中央，將無菌玻璃片貼于B平板中央，C平板不貼物品作對照。3）將3個平板同時放置紫外燈下，打開蓋子，讓紫外燈照射30min。4）照射后， 用無菌鑷子去掉平板上的紙片和玻璃片，蓋好平板，將所有平板一起放35℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。（3）結(jié)果：A和B平板除了紙片和玻璃遮住的部分有細菌生長以外，其它地方都無菌生長；C平板不長菌。（4）注意事項：1）作室內(nèi)空氣消毒時，通常事先關閉室內(nèi)的門、窗，打開紫外燈之后隨即離開，讓其照射30min。返回時，應先管好燈，避免長時間暴露在紫外燈下工作，紫外線對眼睛和皮膚均有損傷。2） 紫外燈殺菌的有效距離為2~3m。（5）適用范圍：因紫外線的穿透力差，故只使用于空氣和物體表面的消毒。【結(jié)果記錄和報告】實驗七 細菌的藥敏試驗及耐藥性檢測【目的和要求】（KB法）、液體稀釋法兩種藥敏試驗的原理和方法。、方法及意義?！驹噭┡c器材】1．培養(yǎng)基：一般需氧和兼性厭氧菌采用水解酪蛋白（MH）瓊脂或MH液體培養(yǎng)基（~）。對于營養(yǎng)要求高的細菌，則需在MH培養(yǎng)基中加入其它營養(yǎng)成分。2．抗菌藥物紙片：~，含有一定量的某種抗菌藥物。市場有售，但生產(chǎn)廠家須獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準。不同種類的待測菌藥敏試驗選擇不同的抗菌藥物，藥敏紙片的選擇見表71。3．待測細菌 接種普通營養(yǎng)瓊脂經(jīng)35℃16~18h的純培養(yǎng)物。4. %麥氏比濁管 配制方法如下： BaCl2 (% W/V BaCl2 . 2H2O) H2SO4 (1%, V/V) 將二液置冰水浴中冷卻后混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6個月。：無菌生理鹽水、無菌棉簽、無菌試管、酒精燈、鑷子、生物安全柜、培養(yǎng)箱等?！緦嶒瀮?nèi)容】一、 紙片擴散法（KB法）藥敏試驗1．原理將含有定量的抗菌藥物紙片貼在已接種待測細菌的瓊脂平板表面，紙片上的藥物隨即溶于瓊脂中，并沿紙片周圍由高濃度向低濃度擴散，形成逐漸減少的梯度濃度。在紙片周圍，一定濃度的藥物抑制了細菌的生長從而形成了透明的抑菌環(huán)，抑菌環(huán)的大小則反映了待測菌對該種藥物的敏感程度。KB法是由Kirby Bauer 建立，美國NCCLS推薦，目前為世界所公認的標準紙片擴散法（定性法）。2．方法（1）培養(yǎng)基的準備：將無菌MH瓊脂加熱融化，趁熱傾注入無菌的直徑90mm平皿中。瓊脂厚為4mm（約23~25ml培養(yǎng)基），瓊脂凝固后塑料包裝放4℃保存，在5日內(nèi)用完，使用前應在37℃培養(yǎng)箱放置30min使表面干燥。（2）試驗菌液準備：將待測細菌接種于普通瓊脂平板，35℃培養(yǎng)16~18h，然后從平板上挑取數(shù)個菌落，于2~，調(diào)整濁度與標準比濁管相同，其細菌濃度相當于108 CFU/ml。（3）細菌接種：用無菌棉拭蘸取已調(diào)試的菌液，在管壁上稍加擠壓之后，手持棉拭于MH瓊脂表面均勻劃線接種，共劃3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60176。角，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，蓋上平板，室溫下置3~5min待瓊脂表面的水分稍干。（4）貼紙片 用無菌鑷子夾取藥物紙片平貼在種好細菌的瓊脂表面，每個平板可貼4~6種藥物紙片。紙片放置要均勻，各紙片中心距離不小于24mm，紙片距平板邊緣的距離應不小于15mm。紙片一旦接觸瓊脂表面，就不能再移動。（5）培養(yǎng)：貼好藥物紙片的平板應于室溫下放置15min，然后翻轉(zhuǎn)平板，放35℃培養(yǎng)18~24h之后觀察結(jié)果。3．結(jié)果觀察和報告將平板置于黑背景的明亮處，用卡尺從背面精確測量包括紙片直徑在內(nèi)的抑菌環(huán)直徑，測得結(jié)果以毫米為單位進行記錄，最后參照NCCLS的標準（見附錄）進行結(jié)果判斷，并以敏感（sensitivity）、中度敏感（morderate sensitivity）和耐藥（resistant）等程度報告之。4．注意事項（1）培養(yǎng)基的成分、酸堿度以及平板的厚度等對試驗結(jié)果都可以造成影響。購買培養(yǎng)基時應考慮其質(zhì)量，對每批MH瓊脂平板均需用標準菌株檢測，合格后方可使用。制備平板時，注意其厚度并且厚薄要均勻。（2）藥物紙片的貼放要均勻，并且要充分接觸瓊脂。藥物紙片應始終保存在封閉、冷凍、干燥的環(huán)境，否則會影響其活性。長期儲存須置20℃的冰箱，日常使用或沒用完的紙片應及時放4℃保存，用時須提前1~2 h取出放室溫平衡。紙片應在有效期內(nèi)使用。（3）菌液濃度也可影響試驗的結(jié)果，濃度大細菌多時抑菌環(huán)減?。痪可贂r抑菌環(huán)則偏大。此外，菌液配好后應在15min內(nèi)用完。（4）培養(yǎng)溫度以35℃為宜。平板的堆放不超過2塊，防止受熱不均。（5）試驗過程嚴格按要求操作，嚴格無菌操作。（6）抑菌環(huán)的測量要仔細、精確。5．質(zhì)量控制：以新鮮傳代的金黃色葡萄球菌ATCC2592大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853等標準菌株在相同條件下用與常規(guī)試驗相同的方法測定對同種抗菌藥物的敏感性，標準菌株的抑菌環(huán)應在預期的范圍內(nèi)。如超出了該范圍，則不能向臨床發(fā)報告，應及時查出原因，予以糾正。標準菌株應每周用MH瓊脂傳代，4℃保存。 6．臨床意義：用于臨床細菌常規(guī)藥敏檢測，監(jiān)測細菌的耐藥變遷，指導臨床用藥。二、 試管稀釋法 1．原理將待測細菌種于一系列含有不同濃度抗菌藥物的液體培養(yǎng)基中，定量測定抗菌藥物抑制或殺死該菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）或最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration,MBC）。2．方法（1）抗菌藥物原液的配制：試驗用的抗菌藥物應為標準的粉劑，選擇適宜的溶劑和稀釋劑進行溶解和稀釋（表72），并配成一定濃度（通常為1000U或1000μg/ml）的藥物原液。原液以過濾法除菌，小量分裝使用，放20℃以下一般可保存三個月，如果置4℃只能保存一周。（2）待測菌液的準備：分純的平板上挑取4~5個菌落，接種于3~5ml MH肉湯中35℃培養(yǎng)4~6h，與標準比濁管比濁，再用MH肉湯按1∶200稀釋，并在15min內(nèi)接種。（3）試驗方法：1）排列試管：取無菌試管10~15支排列于試管架上，除第一管外，其余每管加入MH液體培養(yǎng)基1ml。 2）藥物稀釋：吸取抗菌藥物原液（1000μg/ml），充分混合后，從中吸出2ml分別加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混勻后吸出1ml加入到第三管，以此類推直至最后一管，從最后一管吸出1ml棄去；經(jīng)如此稀釋，各管的藥物濃度依次為512512631；另設培養(yǎng)基對照、待測菌生長對照和質(zhì)控菌生長對照管。3）細菌接種：將已準備好的菌液分別加入到上述各試驗管和對照管中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。4）培養(yǎng)：置35℃培養(yǎng)12~18h后觀察結(jié)果。3．結(jié)果判斷及報告將試管拿出逐一對光觀察，凡無肉眼可見細菌生長的藥物最低濃度即為對待測菌的最低抑菌濃度（MIC）。并以MIC報告之。，經(jīng)35℃培養(yǎng)過夜后，%的種入菌的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度（MBC）。4．注意事項（1）培養(yǎng)基的pH、滲透壓和電解質(zhì)均可影響試驗結(jié)果。（2）抗菌藥物必須使用標準粉劑，不應使用口服藥而影響其含量。配好后的藥物原液應在有效期使用?？紤]到抗菌藥物的效力，不同藥物應選擇不同的稀釋度。（3）試驗過程易污染，應嚴格無菌操作。（4）結(jié)果應在12~18h內(nèi)觀察，培養(yǎng)時間過長，被輕度抑制的部分細菌可能會重新生長，由于某些抗菌藥物不夠穩(wěn)定，時間長了其抗菌活性也會降低，甚至消失，從而使MIC增高。5．質(zhì)量控制：每次試驗應選用金黃色葡萄球菌ATCC2592大腸埃希菌ATCC2592糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標準菌株在相同條件下作平行試驗。如果標準菌株的試驗結(jié)果超過或低于預期值一個稀釋度以上，不應發(fā)出臨床報告，而應找出差錯的原因。6．臨床意義：多用于抗菌藥物抗菌效力的測定，新藥開發(fā)。目前臨床的自動化或半自動化的藥敏試驗多采用與次類似的微量稀釋法。三、部分細菌耐藥表型的檢測1．耐甲氧西林葡萄球菌的檢測（頭孢西丁紙片擴散法）甲氧西林(methicillin)是一種能耐青霉素酶的半合成青霉素。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)因多了一個由mecＡ基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2α）而對甲氧西林耐藥。這種PBP2α不但與β－內(nèi)酰胺類抗生素的親和力極低，而且具有其他高親合力青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的功能。當其他PBPs被β－內(nèi)酰胺類抗生素抑制而不能發(fā)揮作用時，PBP2α可替代它們完成細菌細胞壁的合成，從而使細菌得以生存。MRSA從1961年發(fā)現(xiàn)至今幾乎遍及全球，已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。因此，開展對MRSA的檢測，對于控制醫(yī)院內(nèi)感染的流行，指導臨床治療有著十分重要的意義。（1）原理：同紙片擴散法。由于頭孢西丁和苯唑西林較甲氧西林穩(wěn)定，不易失活，通常使用這兩種藥物代替甲氧西林測定葡萄球菌的耐藥性。（2）方法：以無菌棉拭蘸取已調(diào)試的待測菌液接種于MH瓊脂平板上（同KB法），再貼上頭孢西丁藥物紙片（30μg/片）或苯唑西林藥物紙片（1μg/片），將平板置于35℃培養(yǎng)24h，之后觀察結(jié)果。（3）結(jié)果判斷：頭孢西丁紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)≥20mm為敏感，≤19 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌≥25 mm為敏感，≤24 mm為耐藥。苯唑西林紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)≥13 mm為敏感，≤10 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌≥18 mm為敏感，≤17 mm為耐藥。（4）注意事項：1）頭孢西丁法結(jié)果觀察時應使用反射光線。苯唑西林紙片法結(jié)果需對著透射光線觀察，抑菌環(huán)內(nèi)有任何可辨別的細菌生長即為苯唑西林耐藥。2）培養(yǎng)溫度應為33~35℃，超過35℃耐藥的葡萄球菌可能被抑制不能生長而漏檢。2．腸桿菌科細菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的檢測超廣譜β內(nèi)酰胺酶（extended spectrum βlactamase,ESBLs）是指能水解青霉素類和頭孢菌素類抗生素并擴展到能水解第三、第四代頭孢菌素以及單環(huán)類抗生素并由質(zhì)粒介導的β內(nèi)酰胺酶。自1983年德國首次發(fā)現(xiàn)報道以來，在全世界ESBLs檢出率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢。并具有多重耐藥和轉(zhuǎn)移迅速等特點，極易導致院內(nèi)交叉感染和耐藥菌的擴散。產(chǎn)生ESBLs的細菌主要是大腸埃希氏菌、肺炎克雷白氏菌、陰溝腸桿菌，其他如銅綠假單胞菌、變形桿菌屬及不動桿菌屬也可產(chǎn)生。對ESBLs有多種方法可以進行檢測，目前主要采用美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）所推薦的紙片擴散法、稀釋法，并分篩選實驗和確認實驗兩步進行。（1）篩選試驗（紙片擴散法）1）藥物紙片：頭孢泊肟(Cefprozil,CPD)10μg/片 或頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ) 30μg/片 或氨曲南(Aztreonam,ATM) 30μg/片 或頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 30μg/片 或頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO) 30μg/片） 2）方法：，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基表面貼上頭孢他啶等藥物紙片（同KB法），之后放35℃溫箱中培養(yǎng)1618h觀察結(jié)果。3）結(jié)果判斷： 頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤17mm 頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm 氨曲南抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25mm符合以上任何一項即可認為該菌能產(chǎn)ESBLs。4）質(zhì)量控制：以大腸埃希菌ATCC2