細胞生物學實驗手冊-資料下載頁

　　

【正文】 sa原液、磷酸緩沖液()、生理鹽水等。【實驗內容】 一、微量全血培養 (一)原理 人體外周血中淋巴細胞是成熟的免疫細胞，正常情況下處于G。期不再增殖。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它動物淋巴細胞的有絲分裂刺激劑，它能使處于G0期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，進入細胞周期開始旺盛的有絲分裂。 人體微量全血培養是一種簡單的淋巴細胞培養方法。此法采血量少、操作簡便，在 PHA作用下進行短期培養即可獲豐富的、有絲分裂活躍的淋巴母細胞，適于制備核型標本。各種因素的效應(如病毒、電離輻射、化學藥劑等)也可在淋巴細胞的培養條件下進行觀察，從而進行多種在體內無法進行的研究。因此它是細胞生物學及其它學科研究中的一種有效的方法。 (二)操作 1．打開超凈臺紫外燈20～30分鐘。洗手、換潔凈白大衣后進入操作室。啟動超凈臺，點燃煤氣燈。用75％酒精棉球擦洗手、各種試劑瓶及操作臺面，然后將培養液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超凈臺。 2． PHA溶液，封好備用。 3．用5ml注射器，7號針頭，先吸取少許肝素濕潤針筒，然后從肘靜脈抽血l～2ml。每個培養瓶接種全血O．2ml左右輕輕搖動使血和培養液混勻。 4．在培養瓶上標記好供血者姓名、性別、采血日期等，放入培養箱中37℃培養。每天輕輕震蕩培養瓶二、三次，防止血球沉積并保證血細胞與培養液充分接觸，促進細胞生長繁殖。 二、人淋巴細胞染色體標本制備 (一)原理 在淋巴母細胞分裂高峰時加入秋水仙素，破壞細胞紡錘體的形成，使細胞停止在分裂中期。然后收集細胞，低滲處理，使細胞脹大，染色體伸展。接著進行固定并除去中期分裂相中殘存的蛋白質，使染色體清晰且分散良好。再結合離心技術去掉紅細胞碎片，然后采用空氣干燥法制片獲得中期染色體標本。 (二)操作 1．微量全血細胞培養至68小時左右，用1ml注射器 號針頭向每個5ml培養瓶內加2滴秋水仙素溶液，搖勻后繼續培養3小時，此項操作不需要嚴格無菌。 2．按時終止培養，用吸管溫和吹打成細胞懸液后，移至10ml離心管中。用天平平衡后以1000rpm離心8分鐘，棄大部上清。再吹打成細胞懸液，加入預熱37℃的 ／L的KCL溶液9ml，置37℃水浴中低滲處理30分鐘(這期間配制3:1甲醇一冰醋酸固定液)。 。平衡后以1000rpm離心8分鐘，同樣剩 。 4．輕輕將細胞吹成懸液，加5~6ml固定液，室溫下固定30分鐘。然后離心，棄上清，重復固定一次。再離心，～，吹打成細胞懸液。 5．吸取1～2滴懸液，在距載片約15cm高度滴于預冷的干凈載玻片上，迅速對準細胞吹氣促進染色體分散。斜放載玻片，在空氣中晾干(此期間配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸緩沖液1:10)。 6．將標本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分鐘，自來水沖洗，晾干后觀察。 (三)結果 低倍鏡下，制片質量較好的標本上可看到有較多的分裂相，染色體之間分散良好，互不重疊。 油鏡下觀察可見每一條染色體都含有兩條染色單體，兩條單體由著絲粒相結。分區計數染色體數目并判定性別，或拍照后進行核型分析。 三、腫瘤細胞的染色體標本制備 (一)原理 利用腫瘤細胞無限繁殖的特點，掌握其體外生長動態，取處于對數生長期的細胞便可獲得豐富的分裂相。腫瘤細胞染色體異常包括兩個方面： 1．結構異常 即在腫瘤細胞常出現的染色體畸變，包括雙著絲點染色體、環狀染色體、斷裂的染色體、染色體裂隙及微小體等。 2．數目異常 由于腫瘤細胞分裂失去應有的調控，可出現亞二倍體、超二倍體和多一倍體數目異常現象。 腫瘤細胞染色體制備技術在細胞生物學、醫學遺傳學的基礎研究和臨床診斷、愈后觀察等方面均有廣泛用途。 (二)操作 l． 105個／ml細胞濃度將FL—60細胞接種于培養瓶內，／，移入10ml離心管。其余步驟與淋巴細胞染色體制備相同。 :2傳代進行培養，／ml的秋水仙素處理3小時。按時終止培養，％％EDTA混合消化液處理單層細胞，待細胞收縮變圓時，棄去消化液。加入少許低滲液將細胞從瓶壁洗脫，移入10ml離心管，加入預熱37℃的低滲液至5 ~ 6ml，在37℃處理25分鐘。以下步驟同淋巴細胞染色體核型制備。 (三)結果 計數HeLa細胞和HL—60細胞的染色體數并尋找是否有畸變的染色體。附：人體染色體常規核型的分析 一、人體染色體的觀察 取制備較好的染色體玻片標本，先在低倍鏡下觀察。在標本中選擇一個染色體之間分散較好，互不重疊的中期分裂相，置于視野中央，然后換油鏡仔細觀察。每個染色體都含有兩條染色單體，兩單體連接處為著絲粒。計數時要把分散的染色體劃分為幾個區域以免計數重復或遺漏，然后計數并判定性別。 二、核型分析的方法 人體染色體常規核型的分析，在今天的染色體研究水平上作為染色體結構異常的疾病診斷已經失去意義，但對染色體數目異常仍具有診斷上的價值，尤其是起著分析其它幾種顯帶核型的橋梁作用。通過常規核型的分析必須掌握三點：(一)會分組、(二)了解各組染色體的基本形態特征、(三)會計數數目和鑒定性別。人體染色體的常規核型即按照Denver會議(1960年)提出的染色體命名和分類標準，將人類體細胞的46條染色體按大小、著絲點的位置分成七組(A、B、C、D、E、F、G、)23對的排列。七組染色體的基本形態特征及分析順序是： A組是七組染色體中最大的一組，首先找出它。A組包括三對，即第1~3號6條染色體，第1號為最大、是中央著絲點，長臂近側有次縊痕；第2號第二大、著絲點略偏離中央；第3號為三大，是中央著絲點。 接著確定B組：B組二對即第4～5號4條染色體，較大，均為亞中著絲點，兩者不易區分開。 第三確定D組和G組：D組三對即第13～15號6條染色體，中等大小均為近端著絲點，短臂末端有隨體。G組二對即第21～22號4條染色體，是最小的一組，均為近端著絲點，短臂末端有隨體，長臂常呈分叉狀，21號稍小于22號。Y染色體被隸屬于該組，短臂無隨體，一般較2l、22號大點。 第四確定F組：F組二對即第19～20號4條染色體，染色體比G組稍大、均為中央著絲點。染色體分組形態特征表 第五確定E組：E組三對即第16～18號6條染色體，較小，第16號是中央著絲點，118號是亞中著絲點。 余者為C組：C組七對即第6～12號14條染色體，按大小順序依次排列，均是亞中著絲點；X染色體被隸屬該組，大小居6～7號之間，是亞中著絲點。 上述人的常規核型中，1～22號為常染色體，男女共有，另一對為性染色體，決定性別，男性為XY，女性為XX，人的正常核型寫法：男46，XY；女46，XX。圖15—1 各組染色體基本形態特征的模式圖【作 業】 一、計數HeLa和HL一60細胞的染色體數，它們各屬哪種數目異常? 二、分析制備好的正常人外周血淋巴細胞染色體，判斷其性別。 三、要想制備出好的染色體標本應該注意哪些環節?談談自己實驗成功或失敗的體會。(王明武編)實驗十一 細 胞 融 合【實驗目的】掌握細胞融合原理、應用PEG融合細胞的方法以及細胞融合率的計算。【實驗用品】一、材料 雞紅細胞二、器材和儀器：顯微鏡、離心機、水浴箱、刻度離心管、試管、載玻璃片、蓋玻片三、試劑 50％PEG(MW4,000)、Hanks液()【實驗內容】 一、原理 細胞融合(Cell fusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學的)使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程。人工誘導的細胞融合，在六十年代作為一門新興技術而發展起來。由于它不僅能產生同種細胞融合，也能產生種間細胞的融合，因此細胞融合技術目前被廣泛應用于細胞生物學和醫學研究的各個領域。 細胞融合的誘導物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便，且融合效果穩定。PEG的促融機制尚不完全清楚，它可能引起細胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團發生結構重排。 二、方法 (1)％生理鹽水制成10％的懸液。 (2)(MW=4,000)放入試管內，在酒精燈上融化之，％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。 (3)取上述10％的雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，再加入5ml Hanks液混勻，然后以1,000rpm離心5分鐘，小心棄去上清，用指彈法將細胞團塊彈散。 (4)取上述50％，在1分鐘內滴加到雞紅細胞懸液，邊加邊輕輕搖動混勻。待PEG全部加入后靜置1分鐘左右。此全部過程都要求在37℃水浴內進行。 (5)緩慢滴加9ml Hanks液以終止PEG的作用，在37℃水浴內靜置5分鐘。 (6)離心棄上清后，取一滴融合后的細胞懸液滴片，加蓋片鏡檢。 三、結果觀察 在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的雞紅細胞膜融合在一起，形成一個異核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞。 四、融合率的計算 在高倍鏡下隨機計數200個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，以融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數除以總細胞核數(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。公式如下： 【作 業】l．在顯微鏡下按順序繪制所觀察到的細胞融合各階段，并注明主要特點。2．你測定的細胞融合率為多少?(張之曾編)實驗十二 應用細胞融合技術制備染色體提前凝集標本【實驗目的】 通過細胞融合技術，初步了解染色體提前凝集標本制備原理、方法及間期細胞三種時相的提前凝集染色體特點。【實驗用品】 一、材料 人宮頸癌上皮細胞(HeLa細胞) 二、器材和儀器 顯微鏡、離心機、水浴箱、熱吹風機、10ml刻度離心管、5(1/2) 針頭注射器、試管架、染色槽、廢液缸、吸水紙、擦鏡紙、冰凍載玻片、香柏油瓶、記號筆、酒精燈。 三、試劑 50％PEG、Hanks液()、RPMI一1640培養基(含10％滅活小牛血清，)10μg／ml秋水仙素，／L KCl低滲液、2％檸檬酸鈉溶液、％次甲基蘭染液、1／15mol／L PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。【實驗內容】 一、原理 如實驗十一所述，兩個或兩個以上的同種或不同種細胞可以在誘導物的作用下融合成一個細胞。 七十年代初，由于發現M期細胞內有某種促進染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細胞融合和染色體技術的基礎上，建立了制備染色體提前凝集標本的方法。即讓M期細胞與間期（I期）細胞融合，從而誘導I期細胞染色質提前濃縮成染色體。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。這項技術已應用于細胞周期分析、正常細胞和腫瘤細胞染色體的微細結構的研究、多種因素作用細胞使染色體損傷及修復效應的研究，預測某種血液病的病程、愈后及復發的臨床實踐等方面。 二、方法 1．收集培養的M期HeLa細胞 取一瓶處于對數生長期的HeLa細胞，向培養基中加入10μg／／ml，在37℃二氧化碳培養箱內繼續培養12小時，使大量生長的細胞被阻斷于M期。每組取一瓶經上述處理的細胞，以平行于細胞生長面方向反復振搖，使培養液不斷沖涮細胞層(或用吸管吹打)，M期細胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。將含有M期細胞的培養基移入離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清加人5ml Hanks液，用吸管吹打成細胞懸液。 2．收集培養的HeLa細胞 取一瓶生長良好的HeLa細胞，棄去培養基。％的胰蛋白酶消化2～3分鐘，棄去胰酶消化液。然后加入5ml Hanks液。用吸管吹打成單個懸浮細胞備用。 3．50％PEG的制備 PEG(MW4,000)，倒入離心管中，在酒精燈上加熱使之融化()，放在37℃水浴中待用。 (1)將上述l、2兩管細胞倒入一個離心管中充分混勻。1000rpm離心5分鐘，去掉上清，再小心地吸盡殘液。 (2)用指彈法彈散細胞，在37℃ 50％PEG，逐滴加入離心管內，并不斷地輕輕搖動，整個過程約90秒鐘。然后迅速加入5ml Hanks液以終止PEG的作用。在37℃水浴甲靜置5分鐘。 (3)1000rpm離心5分鐘。棄去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培養基，同時用針頭的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30~60分鐘。 5．制備PCC標本 細胞溫育后，1000rpm離心5分鐘棄去上清，加入10ml ／L KCl低滲液輕輕制成懸液。在37℃處理25分鐘左右；終止時加入lml Carnoy固定液進行固定，1000rpm離心8分鐘，去掉上清，指彈離心管底部使細胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分鐘，1000rpm離心5分鐘，用吸管輕輕吹打成懸液，取預冷的載玻片滴一張片，烤干后，Giemsa染色15分鐘左右，水沖洗，干燥后鏡檢。 三、結果觀察 在低倍鏡下，可以容易地找到M期與I期細胞融合而誘導產生的PCC圖像，由于處于I期不同時相的細胞均能與M期細胞融合而被誘導產生PCC，因此有三種不同形態特點的提前凝集染色體：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。其形態特點分別是： G1期PCC為單線染色體，細長，著色淺呈蓬松的線團狀；S期PCC由于染色體解旋， DNA以多點進行復制，復制后的部分著色較深，以雙線染