細胞生物學實驗指導-資料下載頁

　　

【正文】 短臂長度 按照Levan（1640）標準劃分，－，－，－， 。 ：指短臂占整個染色體長度的比率，他決定著絲粒的相對位置。 短臂長度 著絲粒指數 ＝ —————————— 100 整條染色體的全長 按照Levan（1640）標準劃分，－，－，－，－。 ：是根據著絲粒位置耐確定的，著絲粒位于染色體端部，稱端著絲點染色體，其臂數可計算為一個，若著絲粒位于染色體中部或亞中部的，染色體臂數可計算為兩個。三。人類體細胞核型：人類細胞正常核型含有46條染色體，相互構成23對，其中22對是男女說共有的，稱常染色體，一對為男女所不同的，稱性染色體。女性有兩條X染色體，男性有一條X染色體核一條Y染色體。根據丹佛（1960）、倫敦（1963）、和芝加哥（1966）會議提出的標準，即按染色體的長度依次減少和著絲粒的位置，以及其它特征把人體細胞的23對染色體分為7組：A組：包括13對染色體，中部著絲點、體積最大，易區別，第二對著絲點略偏離中心。B組：包括45對染色體，亞中部著絲點，體積較大，兩對不容易區分。C組：包括612對染色體，亞中部著絲點,中等大小，彼此之間不易區分，以下幾點有助于識別本組中的各對染色體，8號著絲粒靠近中央（短臂較長），12號短臂較短，X染色體大大小介于67號之間。女性細胞中有兩條X染色體，所以共有C組染色體16條（8對），男性則只有1條X染色體，所以C組染色體共有15條（7對半）。D組：包括1315對，近端著絲點，短臂較短，末端可能有隨體，彼此不易區分。E組：包括1618對，中等大小，16號有中部著絲點，長臂上有時又縊痕，118號都有亞中著絲點，后者的短臂較短。F組：包括1920對染色體，都有中著絲點，彼此之間不易區分。G組：包括2123對染色體，都有近端著絲點，短臂末端可能有隨體，長臂常呈二分叉狀。男性細胞的Y染色體也屬于G組，體積略大，短臂末端無隨體，鏈條染色單體長臂常常平行。四、器材準備：。、鑷子。、分規。五、操作方法：，一個細胞的全部染色體，一條一條剪下/，進行分組，并依次序排列。，逐條檢查形態特征與分類標準是否符合，確信無疑時，再用膠水粘貼整齊。六、試驗報告的主要內容：，每組由那些基本特征？？。 實驗十一 線粒體的分離及活性測定線粒體是真核細胞的一個重要細胞器，好氧生物細胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供給，而線粒體是細胞內唯一有氧呼吸的場所，因此，人們就一細胞“動力站”之稱。線粒體結構和功能上的研究至今一直是一個非常活躍的領域，本試驗在于學會分離線粒體和測定線粒體活力，以高活力的線粒體制劑用于各種目的的研究。一、儀器與設備：，或萬轉/分離心機。，研缽、漏斗、紗布（尼龍布）、量筒、微量注射器、移液管、試管等。（氧極普測試系統）。、冰浴。二、材料與試劑：，但最好是生活力強，生長旺盛，幼嫩組織為好，如心肌、肝臟、骨骼肌、黃化幼苗、塊根、塊莖等。（，）緩沖液。（，）。：在1000ml溶液中含有甘露醇（）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（），TriSHCl（，）緩沖液。（同試劑4，但不加BSA）。：在1000ml溶液中含有甘露醇（）、蔗糖（）、KCl（10ml，）、EDTA（）、MgCl2（5mM）、TriSHCl（10mM，）。：α—酮戊二酸 ，ADP 。三、線粒體的分離：線粒體在離體條件先很容易受各種因素（物理和化學的）作用而失活，特別是膜的完整性極為重要，因為只有完整的線粒體才能進行有氧呼吸。所以在分離操作中要掌握以下幾個要點：[1].整個過程要保持在低溫下（04 oC）進行。[2].要注意分離介質的pH值，pH值應和被采用的材料一致。[3].搗碎時間要控制得當，或勻漿適度，爭取獲得更多的完整線粒體。[4].盡可能縮短分離時間，以確保被分離線粒體的質量。不同材料，在分離線粒體的程序上不同，下面列舉兔肝，鼠肝細胞線粒體和馬鈴薯塊莖制備線粒體的分離程序。：將大或小鼠斷頭處死后，盡可能快地取出肝組織放入預冷的蔗糖分離液中，洗滌，稱重，以每克肝組織加8倍分離液，勻漿。詳細步驟如下圖：四、線粒體的形態鑒定 活線粒體鑒定：用懸浮液制的1％janus green B一滴，—1滴在載片上混合，靜止染色20分鐘后，在顯微鏡下檢查，線粒體衩染上蘭綠色，破了膜的線粒體不著色。 電鏡觀察：把分離線粒體在4％戊二醛中固定12小時，再用餓酸固定一小時，然后依次以30％—50％乙醇中各級脫水半小時，70％→80％→95％→100乙醇中脫水各半小時，以上在冰浴中進行，再在溫室下100％乙醇中脫水至干凈后，用環氧樹脂，Epon812或618包埋，超厚切片后，電鏡檢查。 線粒體腫脹檢查把分離線粒體在520nm下，測定光密度值（OD），腫脹線粒體數量高，OD值偏低。五、線粒體活力測定由于實驗目的不同，有其相應指標來鑒別線粒體活性：呼吸控制率（RCR），氧化磷酸化效率和32Pi—ATP交換率可作為鑒定分離線粒體質量指標。 呼吸控制北（RCR）和氧化磷酸化效率（P/O或ADP/O）測定。RCR是反映線粒體結構的完整性及其功能的一個靈敏指標，RCR是指加入ADP刺激后的呼吸（呼吸態Ⅲ）和ADP消耗后的呼吸（呼吸態Ⅳ）之比，即RCR＝RⅢ/RⅣ，RCR值的大小，反映了線粒體氧化磷酸化的偶聯程度，離體的線粒體在測定呼吸時，不加底物下，也有微弱的耗氧，因此在氧電極記錄紙上有較低的斜率直線，這是由線粒體的內源呼吸引起，所以稱為呼吸態Ⅰ，當加入外源底物，α—酮戊二酸和β—氨基丁酸后，耗氧率迅速提高，此時下降的斜率稱謂呼吸態Ⅱ。當加入ADP后呼吸耗氧率進一步升高，此時下降斜率稱為呼吸態Ⅲ，當磷酸化底物耗盡后，線粒體耗氧北又降低，此時斜率為呼吸態Ⅳ，所以根據呼吸Ⅰ—Ⅳ改變即可以了解線粒體結構完整性，電子傳遞及磷酸化偶聯狀態等。氧化磷酸化效率是指線粒體利用氧化釋放能量轉變換為ATP的效率，氧化磷酸化效率可用P/O或ADP/O來表示，P/O是指在某一氧化底物存在下，消耗一克原子氧時，有多少克原子的無機磷轉化為ATP。ADP/O指在同樣條件下，消耗1克原子氧，有多少克分子ADP轉化為ATP。按理論計算，α—酮戊二酸和β—氨基丁酸為底物時P/O或ADP/，將實測值和理論值相比，可檢查出分離線粒體的功能狀態。 32Pi—ATP交換活性測定這也是一個鑒別線粒體磷酸化偶聯活性指標，交換活性大，線粒體偶聯磷酸化活力高。即線粒體質量較好，用未被交換32Pi和鉬酸銨反應生成鉬酸銨，再用分步有機溶劑萃取法提取，被交換的磷形成ATP則分配于水相中，然后由水相抽樣，用定標器或液閃計數器測量其放射強度，再根據放射強度算出交換活性大小。六、測定RCR和ADP/O實例：不同來源的的線粒體，其反應液系統駐條件下不同，這里以黃化玉米苗線粒體為例。，濕度25℃，氧極譜法。（25℃）的反應液注入反應室，打開攪拌器，待溫度恒定后，開啟記錄儀并調節靈敏度及零點，此時的記錄斜率較低直線，為呼吸態Ⅰ。待斜率穩定后加入50ul底物α—酮戊二酸，此時的斜率為呼吸其質存在時氧耗速率，稱呼吸態Ⅱ。 ADP，此時出現較大斜率，謂呼吸態Ⅲ。 ADP盡后線粒體耗氧速率自動降低，稱呼吸態Ⅳ，如果加ADP又回到呼吸態Ⅲ。反應結果ADP/O值計算：氧化磷酸化結果按圖，計算如下：線粒體控制的氧：ADP 加入ADP量（uM）—— ＝ ———————— O 所消耗氧量所消耗氧量＝U/XXV2U：每毫升溶液含UMO2量，25℃為260u mol/L。V：反應液總體積為2ml。X：為2ml反應液所含的溶解氧，相當于記錄紙上幅度（80）Y：為R1Ⅱ格數（30格）Z：為由微克分子氧轉變為微克原子時系數。所以耗氧量＝303022=則ADP/O—＝（或P/O＝），RCR＝RⅢ/RⅣ=30格/14格＝ 注意事項：（1）制備植物線粒體隨組織破碎，伴隨線粒體易膨脹，及內源脂肪酸，酚類物物質可抵制線粒體正常活力，所以制備時注意使用甘露醇，蔗糖維持一定滲透壓力，加合劑和化合物可降低和去除酚類毒害作用，牛血清白蛋白（BSA）可以抵抗，降低脂肪酸或其它脂類毒害作用。（2）線粒體活力，也可以用Warburg計測定，這樣可以同時做幾個材料實驗。實驗報告： 分析實驗過程中所出現每一現象。 寫出實驗測出的線粒體活力，試分析原因。實驗十二 聯會復合體的染色與觀察1977年Moses證明光鏡可以檢查聯會復合體，其后發展了許多用于明視野顯微鏡觀察的方法，依靠光鏡顯示聯會復合體，不僅對SC的構造、功能的研究有用，而且在臨床細胞遺傳學中對研究染色體異常現象也是有用的，它大大加快了SC的研究特別是X、Y染色體配對行為的研究，并導致了X染色體上一種特殊發夾狀結構的表現。一、 實驗目的： 觀察光鏡下聯會復合體的形態。二、 實驗原理：聯會復合體是指在減數分裂前期，同源染色體的配對行為所形成的一種特殊結構，由側線、橫線和中央軸三部分組成，在前期的粗線期結構較典型，它是動植物同源染色體聯會時相當普遍的一種結構。三、 試劑和器材實驗材料： 小白鼠（雄）器 材： 離心機、顯微鏡、水浴（65℃）、培養皿（直徑16cm）、鑷子、剪刀、吸管、燒杯、 量筒、離心管（10ml）、酒精燈、刻度吸管、鏡油、擦鏡紙、載玻片、臺秤。試 劑：① ％檸檬酸鈉溶液。② 3％中性福爾馬林溶液；。③ 50％硝酸銀溶液④ ％明膠；稱取2克明膠粉末，溶解于99ml蒸餾水中，加1ml甲酸。⑤ 甲醇、冰醋酸。四、 實驗方法 脫頸處死動物，取出睪丸，放入盛有1ml ％檸檬酸鈉培養器中。 分離并剪碎精小管，用吸管輕輕吹打，使精小管內容物釋放出。 移至刻度離心管中，加4ml ％檸檬酸鈉溶液制成細胞懸浮液，室溫下低滲45—60分鐘。 在低滲終止前10分鐘，加3％，％混勻。 常規離心（1000rpm，10分鐘），棄去上清液。 加入甲醇和水醋酸（3：1）混合液（臨時用配制）5ml，固定10分鐘。 以10000rpm離心5分鐘，棄去上清液。 重復6—7步一次。 加入1ml新鮮固定液，混勻。 吸取細胞懸浮液，滴2—3滴于濕冷的載玻片上，置酒精燈上略加燒烤。1 銀染：加4滴50％AgNO3和2滴明膠天載玻片細胞面上，混勻，覆以擦鏡紙，置酒精燈上燒烤，至玻片標本呈褐黑色為止。1 以流水沖，去擦鏡紙，晾干。1 鏡檢。五、 實驗報告： 做好實驗記錄。 繪制聯會復合體形態草圖。實驗十三 細胞融合一、實驗目的：兩個以上的細胞合并成為一個雙核或多核細胞稱為融合細胞。人工細胞融合開始于五十年代。六十年代到七十年代作為一門新興的技術發展很快，應用范圍極廣，不僅名類細胞可以全并，種間遠緣細胞也能合并，細胞與組織不同，不排斥異類、異種細胞。動物細胞如此。因此融合細胞的研究成為生物學不論在基礎理論上或生產實踐上開辟了一條新的道路，如目前在核質關系，體細胞的遺傳與發育，新品種的培養，免疫作用，疾病的治療和性狀的改良。潛伏病毒的研究等方面上，有的已取得了顯著的成績，有的正在探索之中。通過實驗對體細胞融合有一個清楚概念。并初步掌握動物細胞合并技術。二、材料和方法（1）取艾氏腹水瘤細胞。用注射器剌入接種瘤細胞7—10天的小白鼠腹腔內吸取1或2ml腹水，注放離心管內；加改良的Hank’s液（）（缺葡萄糖的Hank’s液，Okaba，1962）以800rpm（轉速）離心5分鐘，取出上清液，再入改良Hank’s液，攪拌，再同樣清洗兩次，一次5分鐘，一次十分鐘，最后再加上適量Hank’s液。計算每亳升的細胞數量，如與其它細胞合并用，適宜數目一般為107個/ml，即毫升約1000萬個細胞。（2）取雞血球，在一只公雞的翼靜脈抽取，抽取數量隨需要而定，如取5毫升，可用20毫升針筒，先將針與筒用Alsver液潤濕，吸入50毫升Alsver液剌入翼下靜脈，吸取5毫升液，注入15毫升Alsver液瓶內，使血液與Alsver液的比例為1：4。存入4℃冰箱內務作一星期使用。作實驗時取這種貯備的雞血球1毫升加入4毫升0。85%生理鹽水以1200—1500rpm離心三次（5分鐘、5分鐘、10分鐘），每次離心后去上清液，加0。85%生理鹽水并攪勻，最末一次離心后，根據沉淀血球量的多少，加入適量0。85%生理鹽水使成1%懸液（0。1毫升血球加10毫升液體），取1%懸液1毫升加上2毫升或3毫升0。85%生理鹽水或改良Hank’s液，使每一毫升含有血球1500萬左右。（3）病毒的培養和處理動物細胞的人工合并可用病毒作為介導物，有很多種類病毒能使細胞合并，如皰疹病毒，牛痘病毒，粘液病毒，新域病毒，副流感病毒，仙臺病毒等。其中以新域病毒和仙臺病毒為最佳，特別是Sendai virus,因為在雞胚中培養容易繁殖，我們就是用Sendai virus作細胞合并的介導物。Sendai virus是培養在孵化9—10天的雞胚線毛尿囊腔的內胚層細胞中繁殖，作為種子用的病毒和作為細胞合并的病毒，在培養處理上有所不同，因后者用作實驗，所以需要量也大。接種到雞胚去的病毒，如不沖淡，會產生不完整的病毒顆粒。要得到完整的病毒顆粒，須把病毒沖淡約108到106倍注入量為0。2ml。這是在尿囊液中培養的標準量，為了避免遺傳變性，每五次后改用108到109量一次，接種后雞蛋仍孵化在37℃小時取出，放在20℃，40分鐘或4℃過液，使血液凝結。防止取尿囊液時出血，于是把尿囊液吸出，將每只雞的尿囊液注入一個試管，每管取少許尿囊液，分別培養，檢查有無細胞，并測定血凝效價（HAU），選無菌，效價高的，用無水丙酮快速冰結，保藏作為種子，務下次培養用。吸出尿囊液后，為了消滅病毒感染力，采用紫外光照射。將2毫升病毒懸浮液放入9厘米培養皿內，置于紫外光下，淘汰與培養皿距離為30厘米，10分鐘，每融2分鐘搖動一次，燈光的強度約為20003000爾格/厘米/秒。經過這樣處理的病毒，其感染力或活動力減少1006倍，但血凝效價和合并細胞能力沒有變化（Harris,1976）。取一份Ehrich腹水瘤細胞（107/ml）同一份雞血球懸液1500萬/ml混勻。隨即加入兩份滅活病毒尿囊液。在4℃冰水中，不時催動10分鐘，使細胞凝集。然后置放3745℃溫浴中1530分鐘完成融合過程，鏡檢計數。三、細胞融合的觀察（1）細胞在4℃中凝集，細胞的合并在病毒的參與下進行的，每一細胞要有足夠數量的病毒顆粒附在細胞臘上，細胞才能集合成堆，請注意當腹水瘤細胞與雞血球1：1混合加2份Sendai virus病毒，在