微生物技術與應用核心知識-資料下載頁

【導讀】節蕿螁肅莄螄肀膄蒆薇羆膃薈螃袂膂羋薅袈膁蒀袁螄膁薃蚄肂膀節衿羈腿蒞螞襖膈蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃羅芆蒁蠆羈芅薄薁袇芄芃螇螃芃莆薀肁節蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃蝿莀莂薆肈荿薄螂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃

　　

【正文】 定，微生物在近似恒定狀態（恒定的基質濃度、恒定的產物濃度、恒定的 pH、恒定菌體濃度、恒定的比生長速率）下生長的發酵方式。 ： 能維持低基質濃度； 控制稀釋速率可以使發酵過程最優化，提高設備利用率和單位時間的產量； 發酵周期長，得到高的產量； 便于自動控制。 ： 菌種發生變異的可能性較大； 長時間補料染菌機會大大增 加，要求嚴格的無菌條件。 （ 1）恒化培養：使培養基中限制性基質的濃度保持恒定； （ 2）恒濁培養：使培養基中菌體的濃度保持恒定。 四、固態發酵 ： 是指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固態基質中，用一種或多種微生物發酵的一個生物反應過程。 從生物反應過程的本質考慮，固態發酵是以氣相為連續相的生物反應過程，而液態發酵是以液相為連續相的生物反應過程。從這個定義中可以充分認識固態發酵的特點，以及與液態發酵本質的區別。 固態發酵是氣體作為生 物反應過程中的 O CO熱量、營養和產物的傳遞介質，表現為 O CO2 擴散比較容易，熱量傳遞困難，存在明顯的營養梯度，并且無大量有機廢水產生。 微生物技術應用 11 本質區別是以氣相還是以液相為連續相的差異，具體表現是固體發酵基質中游離水的多少。 固態發酵中微生物生長在缺乏或幾乎不可見液體水的顆粒之間，在固態發酵系統中，微生物可以從濕的基質顆粒中獲得所需的水分。 （ 1）傳統固態發酵與現代固態發酵 依據固態發酵過程中是否能實現限定微生物純種培養，分為傳統固態發酵與現代固態發酵。 （ 2）固態發酵的形式 固態發酵可分為自然富集固態發酵、強化微生物混合固態發酵、限定微生物混合固態發酵和單菌固態純種發酵。 自然富集固態發酵 是指利用自然界中的微生物，由不斷演替的微生物進行的富集混合發酵過程。典型的例子是傳統酒曲和醬油、腌萊、煙草發酵、茶葉發酵、青貯、堆肥等。 強化微生物混合固態發酵 是指在自然富集固態發酵的基礎上，根據人們部分掌握的微生物代謝機制，人為強化接種微生物菌系不明確的富集培養物或特定微生物培養物 所進行的混合發酵過程。 強化微生物混合固態發酵除應用于沼氣發酵、白酒發酵作用外，在石油采收、濕法冶金、食品發酵等領域同樣顯示其優勢。 限定微生物混合固態發酵 是在對微生物相互作用和群落認識的基礎上，接種混合培養的微生物是已知和確定的，通常使用兩種或兩種以上經過分離純化的微生物純種，同時或先后接種同一滅過菌的培養基中，在無污染條件下進行的固態發酵過程。 目前對于具有協同作用關系的菌株篩選和組合還是一個隨機過程的，缺乏有效的理論指導，而且對于已經應用的混合培養體系也不能有效地協調菌間的關系，使其達最佳 生態水平，發揮最大效應。這嚴重地阻礙了混合菌培養的發展和應用。 單菌固態純種發酵 是在純培養基礎上建立起來的，對于選育良種、保持生理活性和代謝過程中的穩定起很大作用。它對于擴大固態發酵的應用范圍和潛力的發揮起到非常重要作用，同時，也是固態發酵一個重要方向。 五、固定化酶和固定化細胞發酵 什么是固定化酶 ？ 固定化酶的優缺點 優點：多次使用、可以裝塔連續反應、純化簡單、提高產物質量、應用范圍廣 缺點：酶在固定化中易失活、首次投入成本高、大分子底物較困難 制備固定化酶的方法 （一）微型膠囊法 是將酶包埋 在各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。 （二）吸附法 1 物理吸附法 優點：固定化時酶分子的構象很少或基本不發生變化。 缺點：結合力弱，易解吸附。 酶分子 + 含有離子交換基團的固相載體 第一個離子結合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化過氧化氫酶 第一個工業化的固定化酶： DEAESephadex A50 固定化氨基酰化酶 （三）膠格包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化 的方法。 （四）共價交聯法 借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，制成網狀結構的固定化酶的方法稱為交聯法。 （五）共價偶聯法：利用酶表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無機或有機載體反應，形成共價鍵將酶固定。 酶分子之間共價交聯和與水不溶性載體共價偶聯酶分子 區別： （ a）共價交聯：酶分子之間 用用 雙雙 功功 能能 基基 團團 的的 化化 學學 交交 聯聯 試試 劑劑 相相 互互 交交 聯聯 成水不溶性的固定化酶； （ b）共價偶聯：酶分子 被被 偶偶 聯聯 到到 水水 不不 溶溶 性性 載載 體體 上上 形形 成成 水不溶性的固定化酶 固定化細胞 一、定義 ：是被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理 化學等因素約束或限制在一定的空間界限內，但細胞仍保留催化活性并具備能被反復或連續使用的活力。是在酶固定化基礎上發展起來的一項技術。 游游 離離 細細 胞胞 相相 比比 ， 固固 定定 化化 細細 胞胞 發發 酵酵 優優 點點 ： 固固 定定 化化 酶酶 相相 比比 ， 固固 定定 化化 細細 胞胞 優優 點點 ：： 三、固定化細胞的缺點 雖然固定化細胞具有上述許多優點，但也有不足之處，具體表現在： ； 、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用； 微生物技術應用 12 ； 。 四、固定化細胞的分類 ：微生物、動 物、植物。 ： （ 1）死細胞：包括完整細胞、細胞碎片、細胞器。適用于一種酶催化的反應。 （ 2）活細胞：包括增殖細胞、靜止細胞、饑餓細胞。適用于多酶反應，特別是需要輔酶的反應。 五、細胞固定化的方法 細胞固定化方法有：吸附、共價結合、交聯、包埋、微膠囊。 六、固定化方法的比較 吸附法：條件溫和、方法簡便、載體可再生。但操作穩定性差。 共價法：操作穩定性高。但由于試劑的毒性，易引起細胞的破壞。 交聯法：可得到高細胞濃度，但機械強度低，無法再生，不適于實際應用。 包埋法：細胞和 載體間沒有束縛，固定化后，細胞仍保持較高活力。但這類方法只適用于小分子底物。 第三節 基因工程菌的發酵 何謂基因工程 基因工程 （ geic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設計十分類似的方法，根據人們的意愿，主要是在體外進行基因切割、拼接和重新組合，再轉入生物體內，產生出人們所期望的產物，或創造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩定地遺傳給后代。 工程菌的獲得 工程菌應具備的條件 工程菌的應用： 利用基因工程菌生產的特點基因工程菌帶有外源基 因，外源基因可能在質粒上也可能整合到染色體上，這些基因可能不穩定。丟失外源基因的菌往往比未丟失的菌生長快得多，這樣就會大大降低產物的表達。為了抑制基因丟失的菌的生長，一般在培養中加入選擇壓力，如抗生素。 基因工程菌的培養一般分兩段。前期是菌體生長，生長到某一階段，加入誘導因子，誘發產物表達。 基因工程菌生長與表達的影響因素 溶氧濃度對工程菌發酵的影響 通過增大通氣量和提高攪拌轉速以保證較大的溶氧值，不僅提高工程菌的生長而且有利于外源蛋白產物的形成。 pH 值對工程菌生長和表達的影響 在相同通氣量和攪 拌速度下， pH 值對不同菌群生長影響不大，而對外源蛋白表達有一定影響 偏堿性的 pH對外源蛋白的表達不利，因此，表達開始要調節 pH 在 之間，以保證外源蛋白的高水平表達。 誘導時間對外源蛋白表達的影響 誘導時間：加入誘導劑后的培養時間 隨著誘導時間的延長，外源蛋白的表達量增加，但外源蛋白在細胞內的積累，對重組菌產生毒性，合成速率下降，甚至產物被分解。 生長速率占優勢的不穩定性 如果改變了的宿主載體系統比原來的宿主 載體系統有生長優勢，那么改變了的系統將最終占優勢，基因不穩定性就出現。 乙酸對生長和表達的影響 第第 四四 章章 微微 生生 物物 發發 酵酵 產產 物物 的的 分分 離離 與與 純純 化化 第第 一一 節節 分分 離離 純純 化化 策策 略略 一一 、 建建 立立 分分 離離 純純 化化 工工 藝藝 的的 根根 據據 生生 物物 發發 酵酵 產產 物物 的的 特特 點點 理理 （（ 1）） 物物 理理 性性 質質 （（ 2）） 化化 學學 性性 質質 （（ 3）） 生生 物物 學學 性性 質質 二二 、 分分 離離 純純 化化 的的 基基 本本 過過 程程 般般 工工 藝藝 過過 程程 一一 般般 說說 來來 ， 分分 離離 純純 化化 的的 基基 本本 過過 程程 可可 分分 為為 4 個個 階階 段段 ：： 培培 養養 液液 (發發 酵酵 液液 )的的 預預 處處 理理 和和 固固