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專題四核酸鑒定技術-資料下載頁

2026-04-28 18:17本頁面

　　

【正文】 1 5 10 A B 足跡 (a) (c) (b) DNaseI 足跡實驗如果使用較大的 DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質因子之間的結合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實驗一樣，我們也可以加入非標記的競爭 DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據此測定其核苷酸序列的特異性。 ? 硫酸二甲酯（ DMS）足跡實驗： DMS能使裸露的鳥嘌呤（ G）殘基甲基化，而六氫吡啶會對甲基化的 G殘基作特異的化學切割。而與蛋白結合的 DNA片段上的 G殘基，不會被 DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在 DNA片段的序列中，不存在這些 G殘基末端的 DNA片段，出現了空白區。甲基化干擾實驗（ methyltion interference assay）根據 DMS（硫酸二甲酯）能夠使 G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的 G殘基這一原理，設計出了另一種研究 DNA與蛋白質相互作用的實驗方法，即甲基化干擾實驗。這種技術可以檢測靶 DNA中特異 G殘基的優先甲基化對而后的蛋白質結合作用究竟會有什么效應，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質之間相互作用的模式。 DMS化學干擾的主要局限性是，它只能使 G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡區段中 DNA與蛋白質相互作用的精確位置。具體操作如下頁圖所示。 G G G G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m G G G m Ⅱ G G G m Ⅱ G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m DNA 局部甲基化與蛋白質提取物混合與蛋白質結合不與蛋白質結合與蛋白質結合凝膠電泳與蛋白質結合的 DNA帶含有 Ⅰ 和 Ⅲ 兩種類型 DNA片段不能與蛋白質結合的 DNA帶含有全部三種類型 DNA片段切下所有結合與不結合蛋白質的 DNA帶，并用六氫吡啶切割甲基化的 G殘基結合帶非結合帶缺失的 DNA帶表明相應 G殘基的重要意義，它得到結合蛋白質的保護甲基化干擾實驗體內足跡實驗 G G G G me G G G G Me Me 完整的細胞裸露的 DNA DMS 硫酸二甲酯分離 DNA并用六氫吡啶切割凝膠分析 PCR擴增受保護的 G殘基應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗 ?DNA核苷酸序列分析（ DNA測序） ?傳統的 DNA序列分析法： Sanger雙脫氧鏈終止法和 MaxamGilbert化學分析法 ? 新發展的 DNA雜交測序法 ? Sanger雙脫氧鏈終止法原理：雙脫氧鏈終止法要求使用一種單鏈的 DNA模板和一種適當的DNA合成引物。利用 DNA聚合酶的兩種酶催化反應的特性：第一， DNA聚合酶能夠利用單鏈的 DNA為模板，合成出準確的互補 DNA鏈；第二， DNA聚合酶能夠利用 2’ ， 3’ 雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之摻入到寡核苷酸鏈的 3’ 末端，從而終止DNA鏈的延長。 MaxamGilbert化學分析法 1977年由。原理：用化學試劑處理末端放射性標記的 DNA片段，造成堿基的特異性切割。由此產生的一組具有不同長度的 DNA鏈的反應混合物，經凝膠電泳按大小分離和放射自顯影之后，便可根據 x光底片上所顯示的相應譜帶，直接讀出待測 DNA片段的核苷酸序列。下一次課內容 DNA的高通量測序 OVER!

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