c1消毒技術規(guī)范20xx版-資料下載頁

【導讀】中華人民共和國衛(wèi)生部。二○○二年十一月。醫(yī)療衛(wèi)生機構消毒技術規(guī)范。消毒技術規(guī)范目錄。一次性使用醫(yī)療用品產品細菌和真菌污染的檢測.......94. 復方消毒產品有效成分含量測定的指導原則..........123. 污物的消毒處理..

　　

【正文】 肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸 數(shù)次，使菌種融化 分散。取含 5 ml～ 10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37℃ 培 養(yǎng) 18h～ 24h。用接種環(huán)取第 1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37℃培養(yǎng) 18h～ 24h。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h，即為第 3 代培養(yǎng)物。 2）用 吸管吸取 ml～ 第 3代～ 5代的 18h～ 24h 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動使菌液布滿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出， 將羅氏瓶 置 于 37℃溫箱內，培養(yǎng) 5d～ 7d。 3）用接種環(huán)取菌樣少許涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在顯微鏡（油鏡） 下進行鏡檢。 當芽孢形成率達 95% 以上 時 ，即 可進行以下處理。否則， 應繼續(xù) 在室溫下放置 一定時間，直至達到上述芽孢形成率后再進行以下處理。 改良芽孢染色法：①用接種環(huán)取菌樣涂布于玻片上，待自然干燥。而后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。②將涂片放入平皿內，片上放兩層濾紙，滴加足量的 % 孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放 54℃ ～56℃ 條件下，加熱 30min。取出，去濾紙，用自來水沖洗殘留孔雀綠溶 液。 ③ 加 % 沙黃水溶液，染 1min。水洗，待干后鏡檢。芽孢呈綠色，菌體呈紅色。 4）羅氏瓶培養(yǎng)物，用 吸管加 無菌蒸餾水于每一羅氏瓶中，以 L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶內吸加 無菌蒸餾水，重復洗菌一遍。將第一 和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖 5min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。 5）必要時，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置 45℃ 水浴中 24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個芽孢。 6）用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液，清除其中的瓊脂凝塊。 7）將過濾后的芽孢懸液，置無菌離心管內，以 3000 r/min 速度離心 30min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，先后共 3遍。 — 32— 8）將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶內蒸餾水中，并加入適量小玻璃珠。 9）將芽孢液放于 80℃ 水浴中 10min（或 60℃ ， 30min），以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于 4℃ 冰箱中備用。 有效使用期為半年。 10）芽孢懸液在使用時，應先進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。 11）懷疑有雜菌污染時，應以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗等法進行鑒定。 菌片的制備程序 （ 1）消毒試驗中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。載體應根據(jù)消毒對象選擇，常用的有金屬、玻璃、濾紙、線、 棉 布等。根據(jù)其特點選擇適宜材料載體作為代表。載體可以為方形，大小為 10mm179。10mm 。 當以金屬片為載體時，因方形金屬載體在振敲時可將玻璃試管撞碎，故改用 12mm 直徑圓形金屬片（厚 ）。 （ 2）所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應進行脫脂處理。脫脂方法如下： ① 將載體放 在含 洗滌劑 的水中煮沸 30 min； ② 以自來水洗凈； ③ 用蒸餾水煮沸 10min； ④ 用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性 ； ⑤ 晾干 、熨平備用。 （ 3）布片用白平紋棉布制作。在剪開前，先將脫脂的布塊按載體規(guī)定的大小，抽去邊緣一周的經緯紗各一根，再按抽紗痕剪開。此法制成的載體大小一致，且無毛邊。金屬片以不銹鋼制作，紙片以新華濾紙制作。 （ 4）載體經壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法 染菌 。 染菌用菌懸液：使用 TSB營養(yǎng)肉湯配制。細菌繁殖體，可直接使用經18h～ 24h培養(yǎng)的斜面 培養(yǎng)物，細菌芽孢可使用 4℃ 冰箱貯存液。含菌量約為 1179。10 8cfu/ml～ 5179。10 8cfu/ml，可使用濁度計調整菌液濃度。 滴染法染菌時，將經滅菌的載體片平鋪于無菌平皿 內，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片為 10μl 。用 10μl 移液器接滅菌塑料吸頭滴染菌液，并用接種環(huán)涂勻整個載體表面。滴染菌液后，染菌載體可置 37℃溫箱內干 燥 （約 20min～ 30min），或置室溫下自然陰干后再使用。 （ 5）每個菌片的回收菌數(shù)，按活菌培養(yǎng)計數(shù)所得結果，應為 5179。10 5 cfu/片～ 5179。10 6 cfu/片。 注意事項 （ 1）用濁度計測定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時對菌懸液稀釋度的估計。作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報告（如殺菌試驗中陽性對照組菌懸液或菌片所含菌量），必須 以活菌培養(yǎng)計數(shù)的實測結果為準，不得使用根據(jù)比濁法判定的估計值。 （ 2）滴染時，菌液滴加量不宜過多，避免流散影響染菌的準確性。 （ 3） 細菌繁殖體在烤干過程中，可引起部分死亡，如銅綠假單胞菌在 37℃ 干 燥 過程中，滴度最高可下降 1個對數(shù)值。此時，應提高初始菌濃度，以便達到所需的菌量 。 （ 4）配制菌懸液和制備菌片時，嚴格按無菌要求操作，以防污染 — 33— 雜菌，影響隨后殺菌試驗的結果。 （ 5）用帶橡皮塞的容器保存菌液時，應將其預先煮沸 10min 進行脫硫處理。 （ 6）制得的菌懸液和菌片，用畢應隨時放入冰箱內，盡量減少在室溫下放置 時間，以 減少 細菌的自然死亡。 活菌培養(yǎng)計數(shù)技術 適用范圍 測定細菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。 試驗器材 （ 1）刻度吸管（ 、 ）。 （ 2） 稀釋液 ：見附錄 A。 （ 3）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 ： 見附錄 A。 （ 4）電動混合器 操作程序 本規(guī)范要求在殺菌試驗中的活菌培養(yǎng)計數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。其操作程序如下。 （ 1）對菌懸液可直接進行培養(yǎng)計數(shù)。對菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應將其上的細菌洗下成為菌懸液后進行培養(yǎng)計數(shù)。洗 菌時，一般以稀釋液為洗液。具體方法如下 : 取含 稀釋液無菌試管，對菌片或小型固體樣本直接投入即可，對棉拭則將其采樣端剪入管內，每管一份樣本。而后，用電動混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80 次），將菌洗下形成菌懸液。以上操作應嚴格按無菌要求進行。 （ 2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上， 每管加入 稀釋液。各組由左向右，逐管標上 10 10 103......等。 （ 3）將菌懸液樣本在用電動混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80次），隨即吸取 101 管內。 （ 4）將 101 管依前法用電動混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80次），混勻，再吸取出 102 管內。如此類推，直至最后一管。必要時，還可作某稀釋度的 1:1或 1:4稀釋。 （ 5）選擇適宜稀釋度試管（以預計生長菌落數(shù)每平板為 15cfu～300cfu 者為宜），吸取其中混合均勻的懸液 加于無菌平皿內。每一稀釋度接種 3個平皿。一般需接種 2個～ 3個不同稀釋度。平皿加樣前，應先按組編號，以免弄混。 （ 6） 將冷 至 40℃ ～ 45℃ 的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾 注于已加入樣液 的平皿中，每平皿 15ml～ 20ml。 （ 7）將平皿蓋好，即刻輕輕搖動混勻，平放于臺上。待瓊脂凝固后，翻轉平皿，使底向上，置 37℃ 溫箱內培養(yǎng)。 （ 8）每日觀察細菌生長情況。培養(yǎng)至規(guī)定時間（細菌繁殖體為 48h，白色念珠菌與細菌芽孢為 72h），計數(shù)最終結果的菌落數(shù)。 （ 9）對菌片和采樣棉拭洗液的活菌培養(yǎng)計數(shù)，先按各試驗要求處理（如去除殘留消毒劑等），而后取其最終樣液按上法進行培養(yǎng)計數(shù)。 （ 10）計數(shù)菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。以菌 — 34— 落數(shù)在 15cfu～ 300cfu的平板為準，每個稀釋度 3 個平板 生長菌落數(shù)全合乎上述標準，則以該 3個平板的菌落平均值作為結果；若有 2個符合上述標準，則以該合格的兩個平板菌落的平均值為結果。 但對黑曲霉菌活菌計數(shù)及殺滅試驗時，平板菌落數(shù)應在 15cfu～ 100cfu之間。 對估計菌量極少的樣本（如消毒處理后樣本），在培養(yǎng)計數(shù)時可不作稀釋，即使平板菌落數(shù)未達 15時，亦可用其計算最終結果。 將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。菌量單位為 cfu。 活菌計數(shù)中技術操作誤差的測定 試驗者在活菌計數(shù)中因技術操作而引起的菌落數(shù)誤差率（平板間、稀 釋度間）不宜超過 10%。對誤差率的自檢，可按以下公式計算。 （ 1）平板間誤差率計算公式 ： %100?? 平板間菌落平均數(shù)平板間菌落數(shù)平均差平板間誤差率 平板數(shù) 的絕對值之和各平板菌落數(shù)平板間菌落平均數(shù)平板間菌落數(shù)平均差 )( ?? 平板數(shù)各平板菌落數(shù)之和平板間菌落平均數(shù) ? （ 2）稀釋度間誤差率計算公式 ： %100?? 稀釋度間菌落平均數(shù)稀釋度間菌落數(shù)平均差稀釋度間菌落數(shù)誤差率 稀釋度數(shù) 的絕對值之和各稀釋度菌落數(shù)稀釋度間菌落平均數(shù)稀釋度間菌落平均差 )(= 稀釋度數(shù) 和各稀釋度平均菌落數(shù)之稀釋度間菌落平均數(shù) = 注意事項 （ 1）嚴格無菌操作，防止污染。 （ 2）認真檢查試驗器材有無破損（要 特別注意試管底的裂痕和破洞），以防丟失樣本和污染環(huán)境。 （ 3）注意菌液的均勻分散。 （ 4）稀釋或取液時要準確，盡量減少吸管使用中產生的誤差。 （ 5）每吸取一個稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。 （ 6）樣液接種于平皿后應盡快傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結果的準確性。 （ 7）傾注時瓊脂培養(yǎng)基溫度不得超過 45℃ ，以防損傷細菌或真菌。傾注和搖動時，動作應盡量平穩(wěn)，以利細菌分散均勻，便于計數(shù)菌落。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結果的準確性和造成環(huán)境的污染。 （ 8）為提高試驗成功率，最好先用濁度計對 原菌液含菌量做出估計，盡可能在首次試驗時所取的有限稀釋范圍內（ 2個 ～ 3個 稀釋度）即有長菌在 15cfu～ 300cfu 之 間的平板。 — 35— （ 9）結果計算時，必須弄清稀釋倍數(shù)，以免計算錯誤。 殘留消毒劑的去除方法 目 的 在化學消毒試驗中，達到規(guī)定消毒時間終點時，要求立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準確檢測出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。因為消毒體系中殘留的消毒劑，可能對微生物的生長繁殖具有一定抑制作用，從而可導致對殺菌效果偏高的錯誤判斷，甚至產生假陰性結果。殘留消 毒劑的去除（下簡稱除藥），可排除殘留消毒劑對微生物的抑制，從而使試驗獲得正確結果。 除藥的原則 （ 1）可有效去除殘留的消毒劑。 （ 2）對微生物無害，不減少微生物應有的回收量。 （ 3）不破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份，不影響其透明度。 （ 4）必須按規(guī)定方法進行鑒定試驗，并認為合格者方可在相應的消毒試驗中使用。 除藥的方法 （ 1）化學中和法：又稱中和劑法，是指在消毒劑與微生物作用到達規(guī)定時間的終點時，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生 物的方法。本法同時含有稀釋作用效果（至少 1:1稀釋，常用 1:10稀釋） ， 是最為普遍使用的方法。 對常用消毒劑，雖有一些中和劑介紹，但在實際應用中由于情況多變，效果不一定都理想。所以，在消毒試驗前仍應將擬用中和劑按試驗具體情況，經鑒定合格后再使用。 操作要點： ① 對接觸消毒劑的微生物樣本，在達到規(guī)定作用時間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中； ② 所用中和劑的濃度與容量應與鑒定試驗結果規(guī)定的相同； ③ 即刻混勻，并按規(guī)定時間吸取樣液進行隨后的培養(yǎng)檢測； ④ 在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應按規(guī)定時間內進行，以免微生物與中 和劑或中和產物接觸過久。 （ 2）過濾沖洗法 將經消毒劑作用過的微生物樣本，立即加入適量稀釋液中混勻（通過適量稀釋，可減輕消毒劑的持續(xù)作用），并傾入裝有微孔濾膜的濾器內，接真空泵抽吸過濾（或加壓過濾）后，再加適量稀釋液沖洗，同時過濾，可去除殘留的消毒劑。多用于難以找到適宜中和劑的消毒劑試驗中，如以植物提取物制備的消毒劑。本除藥方法應按擬進行試驗具體情況，經鑒定合格后再使用。 操作要點： ① 準備好裝有相應孔徑微孔濾膜的濾器； ② 濾膜及濾器需先經滅菌處理； ③ 初次過濾后，應使用一定量對微生物無害的稀釋液進行沖洗，沖洗次 數(shù)一般以洗凈消毒劑為準； ④ 最后一次沖洗、濾凈后，將微孔濾膜以無菌操作法取出，進行隨后的培養(yǎng)檢測。 （ 3）稀釋法 將經消毒劑作用過的微生物樣本，用稀釋液稀釋，降低殘留消毒 — 36— 劑濃度，以消除對微生物的抑制作用。但若稀釋過多，微生物濃度下降，可出現(xiàn)假陰性結果。本法可單獨使用，但更常見的是與其它方法同時使用。單獨使用時，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類消毒劑）。本法應按擬進行試驗具體情況，經鑒定合格后再使用。 操作要點： ① 對接觸消毒劑的微生物樣本，在達到規(guī)定作用時間后，即時以對微生物無害的稀釋液稀釋，稀釋比例隨試 驗需要決定； ② 電動 混合或敲打振蕩，使之混勻； ③ 吸取稀釋樣液進行隨后培養(yǎng)檢測。 注意事項 （ 1）處理時應嚴守無菌操作要求，所有試液須無菌，接觸樣本和試液的器材（如吸管、平皿、試管、濾材等）亦均須經滅菌，以免污染樣本，影響試驗結果。 （ 2）每次吸液，均須更換一支無菌吸管，以防交叉污