棉花高效再生體系建立及其遺傳轉化影響因素的研究碩士學位論文-資料下載頁

　　

【正文】 大量的擴繁繼代，轉化后代階段工作量大。目前，一般首先將目的基因導人易再生基因型，再將之與優良栽培品種雜交、回交，選擇適宜的材料育成品種。其次，植物受傷細胞分泌的某些酚類化合物對農桿菌Vir基因的表達有誘導作用。新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉化影響因素的研究14目前廣泛使用乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮及植物細胞培養液來誘導農桿菌，并在一些轉化中取得好的轉化效果 [91,92]。已有實驗表明，一些自身不能產生對Vir基因具有高效誘導的酚類化合物的植物，使用乙酰丁香酮能產生較好的效果。同樣，在共培養時間短、難以誘導Vir基因表達的情況下,酚類物質的使用可能會產生良好的效果 [93,94]。乙酰丁香酮的使用還可以減小植物基因型的差異，而在另一些植株的轉化上，如草莓等，乙酰丁香酮的使用無效甚至有害。其他物質對Vir基因有誘導作用,如肌醇、非代謝糖類（2脫氧葡萄糖、6 脫氧葡萄糖等） 。采用滲透保護劑甜菜堿和脯氨酸也可以誘導Vir基因的表達。此外,不同菌種Vir基因的誘導效果還與誘導培養基的pH有關。一般說來,農桿菌Vir 基因誘導必須注意以下幾點：①誘導培養基PH值介于5～6之間。②農桿菌培養溫度，當溫度過高超過30℃，將發生質粒丟失；溫度超過28℃，質粒致毒區vir基因不活化，不發生轉化。③培養基中需含有較高的滲透壓 [95]。再有，農桿菌的轉化效率與棉花品種的基因型、外植體類型、共培養時間、再生體系的建立等一系列因素有關。目前研究用于感染的外植體有下胚軸、愈傷組織、子葉、胚根等，獲得轉化植株的報道多數為下胚軸和愈傷組織。侵染外植體的農桿菌采用LBA4404菌株較好，在侵染前要經過活化、～，侵染時間一般為5～15min，共培養時間24～36h。轉化后受體材料最好有一定時間的恢復培養和遵循由低漸高的抗生素梯度篩選，抗生素濃度范圍因抗生素類型及受體材料的不同而變化，卡那霉素濃度范圍一般為 0～100 mg/L [9699]。 目前農桿菌介導法的研究熱點及應用概況目前，利用農桿菌進行棉花遺傳轉化的研究主要集中在：基因的高效啟動和表達[100,101]；農桿菌遺傳轉化體系的改進和優化，即優化遺傳轉化的體細胞再生體系，縮短轉基因植株的再生周期，通過調整培養基成分、固化劑濃度及激素水平，改善體胚成熟、分化、生長的條件，減少畸形苗、變異系的發生 [102]。此外，還有采用嫁接或過渡培養等措施提高轉基因植株移栽成活率，發展轉基因棉花快速測定法，改進轉化條件，提高轉化效率等等。1987年Umbeck 等 [103]人將 NPTⅡ 和 CAT 基因導入珂字312，獲得轉基因再生棉株。在國內，1994年陳志賢等 [104]將 tfdA 抗除草劑基因導入晉棉7號，通過進一步的選擇，培育出晉棉26號（GK951）轉基因抗蟲棉品種。國內外利用農桿菌介導法已將 BtCpTAP 等抗蟲基因，tfdA，Bt，aroA等抗除草劑及抗黃萎病、立枯病15等許多有價值的目的基因導入棉花，并獲得了轉基因植株，且獲得的部分轉基因棉花已進入大田，進行商業化生產 [105107]。 基因槍轉化法 基因槍轉化法的理論基礎基因槍法（Particle gun），又稱微彈轟擊法（Microprojectile bombardment；Particle bomb ardment；Biolistics），是依賴高速度的金屬微粒將外源基因引入活細胞的一種轉化技術。其基本原理是將外源 DNA 包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓作用下將微粒高速射入受體組織或細胞，微粒上的外源 DNA 進入細胞后，整合到植物基因組上，并得到表達，從而實現基因的轉化 [108]。因為微粒的體積非常小，且射擊速度很快，所以外源基因進入細胞后仍能保持正常生物活性，被轟擊過的細胞或組織，雖含有顆粒，但仍能存活，發育不受太大的影響。美國Cornell大學的John Sanford等 [109]于 1987年研制出火藥引爆（ Gunpower）的基因槍。根據基因槍的動力系統，可將它們分為3種類型：一類是以火藥爆炸力為加速動力，也是最早出現的一種基因槍。其粒子速度主要是通過火藥的數量及速度調節器控制；第2類是以高壓氣體作為動力，如以氦氣、氫氣、氮氣等；第3類是以高壓放電為驅動力，其最大優點是可以無級調速，通過變化工作電壓，粒子速度和射入濃度可準確控制。據現有文獻報道，高壓放電和高壓氣體轟擊的轉化率均高于火藥引爆法。 基因槍轉化法的技術特點及影響轉化率的因素應用基因槍技術轉化棉花有以下特點：①無宿主基因型限制，受體類型廣泛。可以采用農藝性狀優良的主栽品種及任何需要改良的棉花類型。②靶受體類型廣泛。可以應用棉花幼胚、愈傷組織、下胚軸、莖尖分生組織等等。③可控度高，重復性好。可以調控微彈的速度和射入濃度，有固定操作程序，規范操作，不確定人為因素較少。不足之處為基因槍轉化體系外源基因整合位點較多，多拷貝比例相對較高，嵌合體比例較高，易出現共抑制和基因沉默現象，遺傳穩定性較差 [110]。關于影響基因槍法轉化率的主要因素分為物理因素和生物因素。物理因素：微彈理化性質及其大小、團聚性、分散性對轉化效果有一定程度的影響；DNA 沉淀劑，常用的 DNA 沉淀劑有Ca 2+ 、亞精胺等，這些化合物的濃度對 新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉化影響因素的研究16DNA 在微粒上的粘附和植物受體細胞的傷害均有重要作用；DNA 的純度、濃度及微彈速度，其中微彈速度是影響轉化率的一個重要因素，它直接決定了微彈對細胞和組織的作用力及產生損傷的程度。不同的植物材料、不同的轉化要求，應選擇不同的速度。生物因素主要是指轉化體系和培養程序。轉化體系包括外植體的種類、細胞的生理狀態、細胞潛在的再生能力、轟擊前后的培養條件以及內環境對外源 DNA 的接受能力等。應選用具有較強分生能力的細胞、幼嫩的組織、幼胚、莖尖等為外植體，并進行預滲透培養處理等使受體處于感受態等，以利于提高轉化率。培養程序是指微粒轟擊受體后，轉化細胞或多或少受到一定傷害，需要有一個恢復調整過程，恢復時間的確定至關重要，過早或過遲移入都會導致再生轉化率下降。剛剛恢復過的受傷細胞通常采用梯度篩選法，即篩選濃度應遵循濃度由低漸高的抗性篩選過程，梯度篩選法起始濃度是很重要的，過低會延長轉化周期；過高又會嚴重降低抗性植株轉化率 [111]。 基因槍轉化法的研究進展和應用基因槍轉化技術在棉花遺傳轉化中尚處于研究和起步階段。John [112]等第一次將此技術應用于棉花遺傳轉化中，以胚性懸浮細胞系為受體進行轟擊，成功得到轉化植株；之后，McCabe [ 113]、Caryl [114]、吳敬音 [115]、朱衛民 [116]等以莖尖分生組織為受體、郝秀英等 [117]以棉花下胚軸為受體，Rajasekaran [118]等用胚性細胞懸浮系為受體均獲得了抗性轉化植株。謝迎秋 [119]對葉肉細胞進行轟擊研究棉花曲葉病毒反式作用因子Ac2的功能等。到目前，使用基因槍進行棉花的遺傳轉化不過十幾年的時間，還有許多問題需要進一步研究。%～% [120]。因此，如何提高轉化率是有待解決的核心問題，國內外的研究主要圍繞轉化前受體材料類型、滲透處理 [121123]、多莖尖誘導及劈開分生組織暴露出敏感層等，研究和提高外植體的接受能力及外植體的數量，同時研究轟擊后細胞的恢復調整和梯度篩選強度等，以提高植株再生效率，優化轉化技術體系，進而提高基因槍轉化率 [124,125]。 花粉管通道法 花粉管通道轉化法的理論基礎1720世紀70年代末，我國學者在遠緣雜交研究中發現，授粉時混入異種作物花粉勻漿，其雜種后代出現了與異種作物相應的性狀變異，推測外源 DNA 可能參與了受精過程。周光宇等結合我國遠緣雜交的成功經驗，提出了遠緣雜交中存在 DNA 片段雜交的假設 [126,127]，其主要內容是，授粉后外源 DNA 能沿著花粉管經過的珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞從而參與到新形成的種子中。由于這些細胞不具備正常的細胞壁，可作為天然的原生質體，易于 DNA 轉化，受精后細胞DNA 復制活躍，易于外源 DNA 的整合。從整體上說，遠緣親本間的染色體結構是不親和的。但從進化的角度來看，任何生物 DNA 均由4種核苷酸組成，這樣就可能在順序上出現不同程度的相同排列，因此部分基因的結構有可能保持一定的親合性。雖然進化中同時存在著相當強的保守性，但生物的主要基礎代謝，如糖、氨基酸、能量代謝、蛋白質和核酸的生物合成與分解等都是共有的（如有90%以上的已知酶在各種生物中都是共有的）。當外源花粉的基因組進入母體（受體）后，大部分片段被分解，僥幸保存下來的某些 DNA 片段有可能整合進入受體的染色體，在子代中表達典型的或更多是非典型的遺傳變異。外源 DNA 片段進入受體，整合是隨機的，可能整合到結構基因中，也可能通過調控基因或重復序列方式發揮作用 [128]。 花粉管通道轉化法的技術特點和影響效率的因素利用花粉管通道法導入外源 DNA，一般有微注射法、柱頭滴加法、花粉粒攜帶法、花粉勻漿法等。棉花為大花、多胚珠、大子房，一般采用幼子房微注射法。選用成鈴率高部位花，開花前一天扎線，嚴格自交，開花后 20～48h 對幼鈴的子房注射外源 DNA。注射前，摘去花瓣，抹平花柱，而后用微量加樣器沿子房的縱軸方向垂直進針，DNA用量和濃度因總 DNA 或質粒 DNA 而不同，總 DNA 用量較多，每次注射1～20uL ，質粒 DNA 用量較少，每次注射 ～10uL。幼鈴采用保鈴劑（如NAA、 GA3等）進行保鈴，提高轉化效率還應考慮溫度、濕度、陽光等環境條件及操作技巧 [129]。花粉管通道轉化法適宜范圍廣，受體類型廣泛，不受基因型限制。利用花粉管通道可以直接對任何棉花基因型進行基因操作，方法簡便，轉化速度快，易于常規育種者掌握，不依賴于組織培養體系，純合速度快；利用活體植株進行轉化，直接獲得轉基因植株，不依賴抗生素篩選，安全性較好。不足之處是外源 DNA 隨機整合新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉化影響因素的研究18到棉花染色體基因組，轉化植株后代遺傳復雜；轉化的時間受自然花期限制；在田間進行操作，受環境條件的影響很大，因此，操作的經驗性很強，需要一定的技術摸索和技巧。花粉管通道法轉化的棉花植株后代遺傳特點：性狀變異廣泛，類型豐富，穩定快，變異頻率較高。研究表明，由外源 DNA 直接導入所引起的性狀變異，涉及棉花的各類質量和數量性狀，包括植株形態、生長發育、生理生化、抗性、產量構成等各個方面，一般變異性狀在第三或第四代就能夠穩定，大大縮短了育種進程。同時，總 DNA導入引起的變異在表型、生理生化產物及 DNA 分子標記的3個層次上與常規育種產生的變異極為相似。通常轉化率為1%～10% 。遺傳較為復雜，有些變異既不是供體性狀也不是受體原有性狀，后代的分離現象，有的符合孟德爾規律，但大多數是不符和的 [130132]。王關林等 [25]認為，裸露的外源DNA 直接導入受體細胞，在轉化過程中進入受體細胞的外源 DNA 拷貝數較多，整合到植物細胞基因組的拷貝數和整合位點也較多，外源 DNA的結構變化復雜，在受體細胞中的遺傳穩定性較差，但已經整合到植物基因組的外源 DNA一般都能穩定遺傳，只是遺傳規律性較差。在轉化后代中還存在外源基因不表達現象等。 花粉管通道轉化法的在棉花上的研究現狀及應用利用花粉管通道法實現棉花遺傳轉化是外源 DNA 直接導入植物體成功的例子之一。龔蓁蓁等 [133]利用 3H 標記的棉花總 DNA 于授粉 24h 后導入棉花子房，分時段取樣，冷凍切片，經放射自顯影，看到授粉后珠心與珠孔已相通，珠心孔道是相當寬的，易于 DNA 溶液進入，80%檢視的胚囊中有 DNA 浸潤。在進入胚囊的途徑中，自顯斑點主要集中顯現在珠心孔道內，即花粉管通道，在花粉管通道以外的珠心組織無標記顯示，表明授粉后形成的花粉管通道是外源 DNA 進入胚囊的天然的唯一途徑。鄧德旺 [134]等報道了采用激光共聚焦顯微技術等細胞生物學方法評價花粉管通道轉基因的技術原理。花粉管通道轉基因技術首先由我國科學家提出并在許多作物遺傳轉化中取得了成功，由于這一工作在初期階段是以總 DNA 為外源基因供體，雖能引起后代發生變異，但對外源 DNA 進入胚囊、卵細胞或受精卵導致核基因組或細胞質基因組的行為及整合機理，以及引起特定而廣泛變異的機制和轉化后的表達與調節等問題缺乏理論上的確切認識，致使國內外一些學者對其可靠性提出了質疑。目前，雖然已取得了后代轉化的分子證據，但仍有許多問題需要進一步的探討，例如外源 DNA 的整19合機理、轉化后代的基因沉默、拷貝數量對表達水平的影響以及外源基因的表達檢測等。之后，我國學者通過此方法陸續將BT、BT+CpTI，SGNA等基因導入中國主栽棉花品種中，目前已育成許多轉基因品種（系）。通過PCR，Southern ，Western Blot 等試驗手段提供了花粉管導入法導入的外源 DNA 整合到棉花基因組，并表達相應性狀的確鑿的分子證據，結合田間直接生物學鑒定，充分證明此方法是一個天然有效的轉基因途徑。該技術的建立開創了整株植物活體基因轉化的新途徑，經過多年來不斷的研究和改進，該技術日趨成熟，在我國棉花轉基因育種研究中發揮著重要作用 [135138]。 GFP 報告基因的檢測綠色熒光蛋白（greenfluorescent protein，GFP）是一些腔腸動物所特有的生物熒光素蛋白。生物熒光素蛋白是指存在于生物體的，能在激發光作用下發射出熒光的蛋白質。1971 年 Morin 等在能夠發出綠光的維多利亞水母（Aequorea