nacl脅迫下玉米幼苗葉片中幾個microrna的real—timepcr鑒定上的畢業論文-資料下載頁

　　

【正文】 0%NaCl處理3h、6h后miR097的相對表達量變化情況圖232 5%、20%NaCl處理3h后miR168的相對表達量變化情況圖233 5%、20%NaCl處理6h后miR168的相對表達量變化情況圖234 5%NaCl處理3h、6h后miR168的相對表達量變化情況 圖235 20%NaCl處理3h、6h后miR168的相對表達量變化情況圖236 10%、20%NaCl處理3h后miR198的相對表達量變化情況圖237 5%、20%NaCl處理6h后miR198的相對表達量變化情況圖238 20%NaCl處理3h、6h后miR198的相對表達量變化情況 實驗數據處理與結果分析 trizol法提取的總RNA的OD值分析及討論我們可以看到trizol法提取的總RNA濃度較高。因為將總RNA溶于DEPC水，所以低離子濃度下A260/，表明純度較高。 trizol法提取的總RNA的電泳結果分析及討論根據總RNA電泳結果可知，28s、18sRNA 2條帶較為清晰，條帶邊緣較為齊整，表明總RNA較少分解、完整度較高，可以用來實時定量PCR。 實時定量PCR結果分析及討論一般情況下，測序得到的miRNA 需要進行Northern Blot驗證或者通過實時定量PCR驗證。傳統的Northern Blot驗證步驟簡便，證據直接。通常的Northern Blot探針有兩種標記方法：（1）地高辛（Digoxin，DIG）標記法；（2）同位素標記法。與Northern Blot相比，通過Real Time PCR 技術對miRNA的驗證既可以省去大量的預雜交與雜交時間，又可以對被檢測的miRNA有一個直觀的、定量的檢測。高效、精確的Real Time PCR技術已被廣泛用來對于miRNA的檢測。傳統的定量PCR技術主要用來擴增80200bp的DNA片段。對于通常長度只有20nt左右的miRNA 來說，傳統的定量PCR 技術只能用來測定miRNA 前體的片段。因此，實驗在對miRNA進行擴增檢測時，通過小RNA反轉錄試劑盒對miRNA的末端添加了一段80nt左右的尾巴序列，這樣就得到了一段帶有miRNA序列的一段100nt序列，通過擴增這一段100nt的序列得到了miRNA 的序列。根據Real time PCR 的原理可知，出現單峰溶解峰的可能為真正的Micro RNA，而那些出現雙峰溶解峰的待檢測Micro RNA 因為有非特異性擴增，可能不是真正的Micro RNA。經過實時定量PCR檢測之后發現，mirNaCl00mirNaCl09mirNaCl16mirNaCl198是真正的Micro RNA。mirNaCl041驗證為假的RNA。 相對表達量的柱狀圖分析分析公式：ΔCT=樣品CT—內參CT ΔΔCT=ΔCT脅迫—ΔCT對照 取—ΔΔCT或2—ΔΔCT 為柱狀圖縱坐標當各—ΔΔCT值差異較為明顯，做出的柱狀圖可以清楚的看到變化趨勢時，可直接采用—ΔΔCT值為縱坐標作圖，其意義為：—ΔΔCT 0時上調表達，—ΔΔCT 1時顯著上調表達，—ΔΔCT 0時下調表達，—ΔΔCT —1時顯著下調表達。當各—ΔΔCT值差異不明顯，做出的柱狀圖可以不能清楚的看到變化趨勢時，可以借助數學上指數函數離散性較快的特點，采用2—ΔΔCT為縱坐標作圖，其意義為：2—ΔΔCT 1時上調表達，2—ΔΔCT 2 時顯著上調表達，2—ΔΔCT 1下調表達，2—ΔΔCT 。① 5%、3h處理時miR003顯著上調表達（—ΔΔCt=），20%、3處理時miR003下調表達（—ΔΔCt=—）。20%、3h處理時miR003顯著上調表達（—ΔΔCt=），20%、6h處理時miR003也上調表達，但上調幅度相對較小（—ΔΔCt=）。我們可以看出，圖219和圖220都有相同趨勢，miR003的上調表達的幅度隨著處理濃度的增加而減少。圖221和圖222都有相同的趨勢，miR003的上調表達的幅度隨著處理時間的增加而增加。根據以上結果可知，miR003的靶基因在較低濃度鹽處理下，表達量快速下降以響應脅迫，在較高濃度鹽處理下表達量無大幅度變化，推測植物對低濃度和高濃度鹽脅迫的響應機制不同，miR003和其靶基因主要參與了較低濃度下鹽脅迫植物的響應過程。而隨著時間的推移，植物受脅迫危害越來越重，miR003的表達自然隨之上升。② miR041的實時定量PCR融解峰出現雙峰，在此不做柱狀圖的分析。③ 5%、3h處理，10%、3h處理和20%，3h處理時miR097的表達量都顯著上升（—ΔΔCt＞4），并且上調表達的幅度隨處理濃度增加而增加。5%、6h處理時的miR097表達量有小幅下降，10%、6h處理和20%，6h處理時的miR097表達量也都顯著上升，上調表達的幅度也隨處理濃度增加而增加。根據柱形圖趨勢分析，5%、6h處理時的miR097表達量數據可能不準確，需要重新進行驗證。由柱狀圖可知隨著NaCl濃度的增加miR097表達量也增加，說明miR097參加了低濃度和高濃度的脅迫響應機制，來抑制靶基因的表達。圖22圖2圖231都有相同的趨勢，說明miR097表達量隨著處理時間的推移而下降。可能是此時有其他的響應機制開啟從而miR097靶基因表達量上調，也可能是miR097靶基因編碼的產物非常重要，不能持續過長時間的下調表達，否則會對植物產生不可逆的損傷。④由圖23233可知在相同處理時間不同處理濃度下，看不出miR168表達量的變化規律。但圖23235的變化趨勢相同，由柱狀圖可知，無論是高濃度處理還是低濃度處理，miR168表達量均隨著時間推移而下調，證明其靶基因在鹽脅迫響應的后期，可能有一定的作用。⑤ miR198的實時定量PCR數據柱狀圖趨勢有較多矛盾之處，可能是由于實時定量PCR時點樣不均或反轉錄時有部分RNA降解。故miR198的數據不可信，需以后實驗進一步分析驗證。參考文獻[1]Boyer,J. S..Plant productivity and environment[J].Science,1982,218(4571):443448.[2][D].海南,海南大學,2010.[3]張建樹,于學文,[M].北京:科學出版社,2006:123[4][5][M].陳月琴,:科學出版社,2010:196241.[6]楊榮武,鄭偉娟,[M].南京:南京大學出版社,2007:313346.[7]Jan Barciszewski,Volker A. [M].:科學出版社,2008:104120.[8]尤永龍,林丹軍,[M].北京:科學出版社,2011:149178[9]楊晶,胡剛,[M].北京:科學出版社,2010:213231.[10]趙可夫,李法曾,[M],北京：科學出版社,2013:1123.[11]劉友,[M].北京:科學出版社,1998:752769.[12]賈庚祥,[J].植物學通報,2002,19(3):272279.[13][J].井岡山師范學院學報,2005,25(5):2328.[14]郭房慶，黃昊，[J].植物生理學報,1999,25(4):395400.[15]郭澤建,[J].植物學報,2000,42(9):881891.[16]金龍國,王川,[J].中國生物化學與分子生物學報,2006, 22(8):609614.[17]李培武,趙永國,[J].中國農業科學,2005,38(7):13461352.[18]李彥,張英鵬,2008,1(24):258265.[19]閻勇,羅興錄,[J].中國農學通報,2007,23(9):323326. [20]張明生,杜建廠,[J]. 南京農業大學學報,2004,27(4):122125.[21]趙可夫,盧元芳,+對小麥幼苗降低鹽害效應的研究[J].植物學報,1993,35(1):5156.[22]Allen E,Xie Z,Gustafson phasing during transacting siRNA biogenesis in plants[J].Cell,2005,121(2):207221.[24]Berezikov E,Guryev V,van de Belt shadowing and putational identification of human microRNA genes[J].Cell,2005,120(1):2124.[25]Carrington J C, Ambros of microRNAs in plant and animal development[J]. Science,2003,301(5631):336228.附錄1 縮略詞RISC：沉默復合體SNP：硝普鈉AM：叢枝菌根CAT：過氧化氫酶ABA：脫落酸SOD：超氧化物歧化酶POD：過氧化物酶DNA：脫氧核糖核酸RNA：核糖核酸ORF：可讀框或開放閱讀框附錄二 realtime CT值CT值miR003miR041miR097miR168miR1985%,3h,NaClNA10%，3h, NaClNA20%,3h, NaCl5%,6h,NaCl10%,6h,NaClNANANA20%,6h,NaClCk致謝時光飛逝如白駒過隙，大學四年生活即將畫上圓滿的句號。過去的四年使我獲益良多。在學習上，對專業知識有了更深的了解。在思想與生活上也取得了一定的進步。這四年的時光，印記了我精彩人生中的一劇刻骨銘心的寶貴經歷。在此，我向過去的四年里在學習、生活中給我帶來幫助的人們表示誠摯的感謝。首先，我要感謝我的論文導師武永軍副教授。從論文的選題到體系的安排，從觀點推敲到字斟句酌，無不凝聚著武老師的心血。他嚴肅的科學態度、嚴謹的治學精神、精益求精的工作作風，深深地感染和激勵著我。感謝武永軍老師在畢業設計期間提供的寶貴學習環境及在課題研究中給予的指導、在實驗中以及論文撰寫和修改中給予的意見和建議。武老師的寶貴指導是本論文得以完成的基礎。其次我還要感謝本實驗室的李鶴松、王維嘉、李龍、楊應棟等同學在實驗過程中的合作與幫助。有了他們的合作，實驗才得以更加順利的完成。最后，我要感謝我的父母、家人、同學對我一如既往的支持，正是依靠他們的鼓勵與支持才能使我能夠安心求學、順利完成學業。我的畢業論文離不開老師、親人及朋友在這四年來對我的付出和關照，我再次向他們表示最誠摯的感謝和最崇高的敬意。 謝璽2014年6月3日42