基因工程：第六章大腸桿菌基因工程-資料下載頁

　　

【正文】 基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制 工程菌遺傳不穩定性的表現形式 基因工程菌的遺傳不穩定性主要表現在重組質粒的不穩定性， 這種不穩定性具有下列兩種表現形式： 結構不穩定性 重組 DNA分子上某一區域發生缺失、重排、修飾，導致 其表觀生物學功能的喪失 分配不穩定性 整個重組 DNA分子從受體細胞中逃逸（ curing） 基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制 工程菌遺傳不穩定性的產生機制 受體細胞中的限制修飾系統對外源重組 DNA分子的降解 能量、物質的匱乏和外源基因表達產物的毒性誘導受體細胞 外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝 產生應激反應：關閉合成途徑，啟動降解程序 重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分配 這是重組質粒逃逸的基本原因 受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排 基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制 重組質粒的逃逸率 一部分細胞不再攜帶重組質粒，這些空載細胞數與總細胞數之比稱為 當含有重組質粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養系統中 稱為重組質粒的 宏觀逃逸率 。重組質粒逃逸的原因有： 高溫培養、表面活性劑（ SDS）、 藥物（利福平）、染料（ 吖啶）促使重組質粒滲漏 受體細胞中的核酸酶降解重組質粒 重組質粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質粒 拷貝數的差異隨著細胞分裂次數的增多而加劇 改善基因工程菌不穩定性的策略 改進載體受體系統 以增大質粒穩定性為目的的構建方法包括： 將 R1質粒上的 parB基因引入表達型載體中， 其表達產物可以 選擇性地殺死由于分配不均勻所產生的無質粒細胞 正確設置載體上的多克隆位點， 禁止 DNA片段插在穩定區內 將受體細胞的致死性基因安裝在載體上， 同時構建條件致死 性的相應受體系統，如大腸桿菌的 ssb基因（ DNA單鏈結合 蛋白編碼基因 改善基因工程菌不穩定性的策略 施加選擇壓力 根據載體上的抗藥性標記，向培養系統中添加相應的抗生素 藥物和食品生產時禁止使用抗生素 根據載體上的營養缺陷型標記，向培養系統中添加相應的營 培養基復雜，成本較高 養組份 改善基因工程菌不穩定性的策略 控制目的基因的過量表達 使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度 使用可控型復制子控制質粒的定時增殖或降低質粒的拷貝數 優化基因工程菌的培養工藝 培養基組成： 限制培養基比豐富培養基更有利于穩定 培養溫度： 較低的培養溫度有利于重組質粒的穩定 E 利用重組大腸桿菌生產人胰島素 6 大腸桿菌基因工程 胰島素的結構及其生物合成 人胰島素的生產方法 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 胰島素的結構及其生物合成 S S S S C N S S B 肽（ 30） C 肽（ 31） A 肽（ 21） R R R K S S S S C N S S N C 高爾基體內的特異性肽酶 N C 信號肽 B 肽 C 肽 A 肽 信號肽酶 人胰島素的生產方法 直接提取法制人胰島素 迄今為止，有四種大規模生產人胰島素的方法： 早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，由于原料 供應的限制，其產量遠遠不能滿足日益增多的糖尿病人的臨 床需求。 人胰島素的生產方法 化學合成法制人胰島素 根據人胰島素 A鏈和 B鏈的序列，由單個氨基酸從頭合成。這 條化學全合成的路線從技術上來說是能夠做到的，但其生產 成本奇高，從而也限制了產品的廣泛應用。 人胰島素的生產方法 化學轉型法制人胰島素 豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素 與人胰島素只在 B鏈的 C末端有一個氨基酸的差異，豬的為 Ala， 人 的為 Thr， 因此將豬胰島素在體外酶促轉化為人胰島素不失為一種 選擇。 上述思路的技術路線是：在 pH為 67的有機相中使胰蛋白酶催 化其逆反應，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素 B 鏈 C末端的丙氨酸交換下來，所形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙 酸脫去叔丁酯基團，最終獲得人胰島素。該過程的總轉化率為 60% 但工藝路線耗時，分離純化操作復雜，產品的價格不菲。 人胰島素的生產方法 基因工程法制人胰島素 1982年，美國 Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產人胰島 素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。 1987年， Novo公司 又推出了利用重組酵母菌生產人胰島素的新工藝。 上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素 受體結合 性能 、 淋巴細胞和成纖維細胞的應答能力 、 降血糖作用 、 血漿藥代 動力學 等指標上均與天然胰島素沒有任何區別，而且還具有 無免疫 原性 、 注射吸收迅速等 優點，充分展示了基因工程在生物醫藥領域 中的巨大潛力。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 A鏈和 B鏈分別表達法 基因工程菌的構建戰略： tac tac bGal bGal A peptide B peptide ori ori Apr Apr Met Met Met Met M M N C M M N C 化學合成 A鏈 和 B鏈的編碼 序列 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 A鏈和 B鏈分別表達法 表達產物的后處理路線： M M N C M M N C bGal bGal A B CNBr 處理 N C S S S S C N S S N C N C N C N C Cys 體外氧化和重折疊 分離純化 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 A鏈和 B鏈分別表達法 生產技術的評價： 由于 A鏈和 B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正 確配對率較低，通常只有 10% 20%，因此采用這條工藝路線生 產的重組人胰島素每克成本高達 100美元 以上。 為了進一步降低生產成本，美國 Ely LiLi公司隨后又建立了第 二條生產重組人胰島素的工藝路線。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 人胰島素原表達法 基因工程菌的構建戰略： tac bGal C peptide ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 人胰島素原的 cDNA 重組人胰島素原 轉化 分離純化 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 人胰島素原表達法 表達產物的后處理路線： S S S S C N 胰蛋白酶 C peptide A peptide B peptide M R R K R CNBr R S S S S C N N C S S S S R 羧肽酶 B B鏈中第 22位上的 Arg和第 29 位上的 Lys由于良好折疊的原 因，對胰蛋白酶不敏感 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 人胰島素原表達法 生產技術的評價： 在人胰島素原表達工藝中，由于 C肽的存在，胰島素原能形成 良好的空間構象，三對二硫鍵的正確配對率也相應提高，折疊率高 達 80%以上。雖然這條工藝路線并不比 AB鏈分別表達法更為簡捷， 而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上 彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產品的成本僅 50美元 。 目前美國 Ely LiLi公司采用此工藝年產 十幾噸 的重組人胰島素。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 A鏈和 B鏈同時表達法 tac bGal ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 化學合成 AB鏈編碼序列 重組人胰島素 轉化 分離純化 CNBr 處理 特異性裂解 體外折疊 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 分泌型重組人胰島素表達法 上述三種重組大腸桿菌的構建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶 基因拼接的方法，所產生的融合型重組蛋白表達率高、穩定性強，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質中。一種能促進融合蛋白分泌的工程菌構建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與 b內酰胺酶 基因拼接， b內酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時具備了穩定高效表達可分泌型融合蛋白的優良特性，為胰島素的后續分離純化工序減輕了負擔。