降解酒糟生物質的纖維素分解細菌的篩選及產酶研究_大學本科畢業論文-資料下載頁

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【正文】 第 16 頁 上表 單菌株純培養崩解濾紙條試驗結果，除了 2株細菌 BL5106一具有一定降解濾紙條的能力外，其他單菌株在連續 8d的恒溫振蕩培養過程中不能使濾紙條崩解，這也可能是培養時間不夠長，或是濾紙成分構成的原因。 結合生長曲線測定的 OD可以推斷，液體渾濁度高的相對的 OD就大，對濾紙的分解能力相應也會較強。渾濁度高的菌懸液，其細菌的生長繁殖速度快，繁殖能力較強。 濾紙這種非天然纖維素底物化學組成均一、試驗結果重復性好，是普遍選用的篩菌底物，但用其進行的纖維素酶活性檢測不能真實地反映菌株對酒糟這類復雜組分的纖維素的降解能力。 所以，濾紙崩解試驗可以用作菌株的篩選之中，但不能作為判斷酶活力大小的依據。 下 圖 一組 以 LB去除碳源為培養液，添加濾紙作為唯一碳源，接種一環連續培養 5d后，培養液及濾紙的出現的一些直觀情況，以此可作為挑選菌株的參考依據。 圖 接種細菌下的培養液與濾紙 通過觀察發現， 具有較強的纖維素酶活性的 13株細菌，原先能在 CMCNa培養基上產生大而清 亮的透明圈，但在濾紙條崩解試驗中卻沒有明顯的效果，只是顯得渾濁。 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 17 頁 4 結果與 討 論 從茅臺酒廠提供的樣品中分離到近千株菌，經過革蘭氏碘液染色，共得到能產生透明圈的菌株 244株， 其中，有 4株菌菌落半徑達到 cm， BL595透明圈與菌落半徑比值最大的達到 15，透明圈與菌落半徑比值超過 10的有 12株，透明圈與菌落半徑比值超過 5的有 103株。在這 103株菌中，最具研究價值的有近 20株，本試驗著重選取了其中 13株，分別是 50 176。C條件篩選的 7株和 30 176。C條件的 6株，對其進行各項指標的測定，主要偏重于其纖維素酶活的測定。 通過濾紙的崩解試驗找到重點目標，最后， CMC 酶活和 FPA 酶活研究結果表明，這 13 株菌在分泌纖維素酶活力及降解濾紙能力方面， BL5106，不管是從其一開始的生長速度（生長曲線），對環境的適應能力（濾紙崩解），還是對CMC 的分解能力都顯得尤為凸出。 其中分解纖維素的酶活力最高的 BL5106達到 U/ mL。通過各細菌生長曲線可以看出，在條件適宜的情況下，前期（ 1d）細菌群落生長便已趨于穩定，隨著時間的推移，有小幅變化，在培養的中期（ 4d） ，便有部分菌株進入了衰落期，菌懸液的 OD出現下滑趨勢，但總體趨勢并沒有變化。 在 30 176。C 和 50 176。C 培養條件下，前期，高溫培養的細菌生長快于低溫培養，但 3d 之后，二者趨向平衡；后期， 30 176。C 條件下篩選的部分菌株（ BL5106）性能優于 50 176。C 條件下篩選得到的菌株。 在震蕩條件下培養，菌體懸浮液面生長，并連接成團，沒有均勻散開，所以雖然在培養后期（ 2d），以肉眼可見大量聚集成團的菌落，但 吸光度 變同時間沒有相關性。而在 30176。C 靜置條件下培養，菌懸液散步較均勻，長期培養下（ 4d）除 BL599 和 BL5106 外，其余菌液管液面上均有稀薄的一層菌落。兩種培養方式均 有氣體產生。 另外，同一菌種分小批分別接種培養的方式最后得出的數值存在較大誤差，若同一菌接種到 250 mL的三角瓶中，在不同時間段取液保存測定可能更為直觀，因為株菌的生長環境變化不大，也沒有隔離。 從試驗中可以看出， 單菌株濾紙條崩解實驗證明單株細菌對濾紙條纖維素的分解能力比較弱， 通過 查閱有關文獻，知道有通過多菌種混合培養，利用不同菌種分泌的多種酶之間的協同作用，得到對濾紙條纖維素具有較強分解能力的菌 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 18 頁 株組合。這說明纖維素的有效分解需要多菌種分泌多種酶的協同參與。 人們對纖維素酶活力測定方法進行了大量的研究， 自 20 世紀 60 年代以來，提出了許多不同的測定方法。 1984 年，國際理論和應用化學協會的發酵委員會確認濾紙酶活力測定法為標準方法。濾紙酶活力法測定總酶活力雖然是一種通用的、公認的、經典的方法，但由于其底物為濾紙是不溶性的，結構比較復雜，不同廠家生產的濾紙也不同，對實驗結果有一定的影響，因此，對濾紙品種的要求也十分嚴格。在近來的總酶活力測定過程中發現，國產濾紙的質量有所變化，其本底值過高，給測定帶來 較大的誤差，而且作為底物的濾紙需要裁成一定重量的小條，比較麻煩。對于活力較低的樣品來說，其靈敏度較差。更為主要的是這種方法的反應時間比較長，不利于快速測定，這在生產中是很不方便的 [18]。 因纖維素空間結構和纖維素酶酶系組成對纖維素分解效果影響顯著。經高溫蒸餾的酒糟中纖維素的晶狀結構被部分破壞，有利于纖維素酶的作用。還有如梁如玉等對含纖維素底物進行化學的或物理的預處理，可大大提高底物對酶的敏感性，減少底物的抗性，提高纖維素轉化率。 在通常情況下，影響酶活力的因素較多，如酶的濃度、底物的結構和性質、pH 值、 反應溫度等。另外纖維素酶活力的測定方法也很多，至今沒有統一， 這就造成了相互之間無法比較活力的情況。 還有纖維素酶酶系組成和纖維素的結構對分解纖維素的效果有明顯的影響。酒糟中的纖維素部分被木質素和半纖維素包裹，對纖維素酶有鈍化作用；而在白酒蒸餾過程中，酒糟中纖維素的晶狀結構被部分破壞，有利于纖維素酶的作用。產纖維素酶酶活和濾紙酶活高的菌株分解酒糟的效率不一定好。 又由于纖維素酶是一種誘導型復合酶系，單一菌株降解纖維素的能力有限，需要多菌種協同才有可能最大化地降解纖維素，所以本試驗所獲菌株單獨降解纖維素能力可 能有所不足。 通過以上試驗，對所篩選的細菌有做了進一步的淘汰，在得到 1株較為高效的纖維素分解菌的同時，也建立了初步的探究模式，這為 下一步的工作創造了便利。 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 19 頁 參考文獻 [1] 李新社 , 陸步詩．大曲酒糟代替米糠生產小曲的效果研究［ J］．釀酒 科技 , 20xx(7):65 －66． [2] 張禮星 , 王華．里氏木霉纖維素酶在大曲酒酒糟中的應用 [J]．釀酒科技 , 20xx, （ 3）： 5253． [3] 江龍法 ．分解酒糟生物質的纖維素酶生產菌的篩選研究［ J］．自然科學版 , 20xx, 15(4):51 － 54． [4] 熊世勤 , 彭謙 . 耐熱纖維素酶產生菌及產酶條件 [ J ]. 云南大學學報 (自然科學版 ) , 1998, 20 ( 2 ) : 91 94. [5 ] Bayer EA , Chanzy H , Lamed R , et al . Cellulose , cellulases and cellulosomes [J ] . Current Opinion in Structural Biology , 1998 , 8( 5) : 548 557. [6] 史央 . 秸稈降解的微生物學機理研究及應用發展 [J ] .微生物學雜志 , 20xx, 22 (1) : 47 50. [7] 張影 . 一株生孢噬纖維菌的分離純化、鑒定及降解纖維素濾紙過程的研究 [D]. 長春：東北師范大學 , 20xx. [8] 郭愛蓮 , 楊琳 , 劉梅 , 等 . 產黃纖維單胞菌纖維素酶的培養條件 [J]. 西北大學學報：自然科學版 , 1999(6) ： 575577. [9] 謝菊蘭，肖兵南，周望平 . 一株產黃纖維單胞菌的選育及產酶特性研究 [J]. 微生物學雜志 , 20xx(1)： 4144. [10] W. Schwarz. The cellulosome and cellulose degradation byanaerobic bacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 20xx， 56(56) . [11] 吳斌 , 胡肄珍 . 產纖維素酶放線菌的研究進展 [J]. 中國釀造 , 20xx(1)： 58. [12] 李日強 ．纖維素類廢棄物的綜合利用．中國環境科學 , 20xx, 22(1)： 2427． [13] 秦廣利 ．纖維素酶對白酒酒糟資源化利用研究．釀酒科技 ,20xx(4) :2225 [14] 沈萍 ． 微生物學實驗［ M］． 4 版．高等教育出版社 , 20xx:85120． [15] 王淑軍 , 楊從發 , 陳靜 . 固態降解農作物秸稈纖維素菌株分離篩選方法的研究 . 淮海工學院學報 , 1999 , 1 (3) :42～ 45 [16] 管斌 , 丁友昉 , 謝來蘇 , 等 . 還原糖測定方法的規范 [J]. 無錫輕工大學學報 , 1999, 18(3): 74?79. [17] 胡丹 , 劉霞 , 雷頡 .高產纖維素酶青霉菌的篩選和及產酶條件的研究 [J].現代食品科技 , 20xx, 23(3):1417 [18] 李亮亮 ．纖維素酶活力測定方法的比較研究 [ J] . 遼寧農業科技 , 20xx, ( 4) : 1618． 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 20 頁 致 謝 有的 事 ，在做的時候沒有顯出有什么意義，但回過頭才發現意義所在。 從確定指導老師的那 一刻開始，我和平京很是興奮了一陣，因為 未來的 指導老師， 是 剛來我們學院的易維潔博士，易老師的學識及為人是我們 激勵我們的源頭。 選題之初， 易老師就告訴了我們接下來 將 要 面對的重重困難，沒有實驗室、沒有設備、工作量大且試驗有極大可能 達不到理想的效果 ，但一切聽在我們耳中 ，則變成 證明自己的有利條件而已， 并沒有放在心上 。 接下來， 抱著極大熱情與期待投入到了 試驗之中 ， 我們整理實驗室，將每一件物品擺設好，當看到起初凌亂不堪的實驗室為之煥然一新 時，很是給 我們 加 了把勁 ，即使我們還缺少設備，但至少我們 擁有了南區最好的實驗室。 在我們的迎接下，設備一件件加入到了我們奮斗的大業中，隨我們一起沖殺在試驗前線，感覺前途一片光明，隨著設備增添，試驗也逐漸展開了。我們設計思路，制定方案，清洗儀器，準備 器材，同時實驗室也迎來了第一批客人，茅臺酒廠派來的 “ 監工 ” ，我們一起開始了菌種的分離。此時，誰也不會想到，最后我們會在這里留下那么多遺憾，此時的我們只會想到成功會屬于我們，也只可以屬于我們，因為我們有最好的導師 。 而事實證明 ，沒有足夠的努力，就不會有最好的結果。 最后，試驗結果 是 出來了， 但 沒有讓我們 滿意，一點也不滿意，雖然我們在其中投入了大量的時間，但試驗的成敗從來不是與投入的時間成正比的。也許是一開始的期待太大，所以會對結果失望吧！ 在本論文完成之際，我要向所有幫助過我的老師、同學表示衷心的感謝！ 但我最想 感謝的是我的導師， 您的嚴謹細心，負責溫和感染了我，這份影響很珍貴！ 謝謝您！易老師！