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【正文】 －－－－－－－－－－－－3694 －－－－－ －－－－－－ －－124310【45】92kd的蛋白應選什么濃度的分離膠和濃縮膠啊答：【1】分離膠的濃度和最佳分離范圍：（1）SDSPAGE分離膠濃度 －－－ 最佳分離范圍 （KD)6%膠 －－－－ －－－－－－－－50150 8%膠 －－－－ －－－－－－－－3090 10%膠 －－－－－－－－－－－－2080 12%膠 －－－－－－－－－－－－10－40 （2）分離膠濃度（％）當然，再過一會，這些條帶也會變白的，所以，要一直看著。所以，你現在首先要確定目的蛋白轉到膜上了。一般都是衡流吧。先用考馬斯蘭染一下膠，證明膠上有。【1】分子量小，電泳的時候不要時間太長。但是敷育抗體后沒有做出。【44】各位大蝦，其有復合物25KDa（二硫鍵結合）。當然，前面已經說了。我顯影和定影液各自配了500毫升。前面的方法都用了，還不行的話，就要注意這一點了。【6】（曝光后白板一張，不存在背景過強的問題），可以增加二抗的濃度，增加二抗的孵育時間。【42】求助各位戰友，轉膜完用麗舂紅染色有條帶，但是一抗二抗孵育后ECL顯影照相沒條帶，急答：【1】目的條帶沒出來，首先確定樣品里有沒有這種蛋白，含量如何？【2】可以加大上樣量，或/并提高蛋白濃度。我就是用塑料袋做成小袋子，然后把膜放到里面，然后把一抗稀釋液放到里面。所以，一種一抗稀釋液用多長時間，一般只有用了才知道。還是抗體在稀釋后應放4度保存？另外我想問一下這樣的抗體一般可用幾次。盡管后來都淬滅了。我以前都是用保鮮包裹膜，然后曝光，但是保鮮膜太薄，容易卷起來，我就用較厚的塑料袋，但是發現熒光一接觸塑料袋就迅速淬滅，我估計可能是因為后塑料袋上不干凈，有些導致淬滅的物質。各溶液使用后，請蓋緊瓶蓋，以防失效。因為有些桌子是金屬的，所以放到上面會導致熒光迅速淬滅。我在版上和PIERCE的說明書上仔細的學習過了，都是說二抗的濃度高，后來我就把二抗降到說明書推薦的1：5000,在暗室中觀察加上顯色底物熒光非常暗，但還是會很快消失。我也曾試過我二抗濃度降到推薦的最低，可是還是不行。正好是5倍的關系，你的配方是正確的。還有個問題，為什么電泳液使用時要配成1*的？往蛋白里加的loading buffer終濃度也要調至1*？答：【1】所謂的1就是說是應用時應該應用的濃度。Marker每次都比較模糊，有時候條帶不全，不知道是轉過還是沒有轉夠？答：預染的MARKER一般來說，所有的條帶都很清楚的轉到膜上挺難的，但是有一些條帶還是應該比較清楚的。如果目的蛋白低表達的話，可以把上樣量加到100微克。一般來說是15秒－20分鐘的時間，只要泡透就行了，在甲醇里，膜一般是很容易透的。其他的繼續做。）請各位戰友幫我分析一下問題在哪兒，感激不盡！！！答：【1】ECL的靈敏度遠大于麗春紅，所以麗春紅染色染不出，曝光的時候同樣可能曝出來的。【38】做WB幾個月了，一直不成功，很郁悶，請各位戰友幫忙分析一下問題出在哪了，先在這里謝過！！我做的目的蛋白有兩個，分子量分別為28KD和57KD，內參是action，分子量42KD，使用藍色預染蛋白Marker，跑膠結束后可以看到Marker條帶，基本與說明書上的圖示吻合，用考藍G250染色，可以看到Marker以及蛋白樣本的條帶。轉移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，％ SDS，20％甲醇）甘氨酸（） Tris（） SDS 甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3～5次。可能是轉移槽的蓋子沒蓋緊，電源沒接上，轉移槽支架上的金屬絲斷了，或者某個地方的電線接觸不好。但是這可以告訴我們，做法是對的，適當提高一抗的濃度或者增加蛋白濃度一般會有較好的效果。【3】抗體的濃度要摸一下，這也挺重要的。所以我的培養皿是非常多的，用完了，就用洗滌精洗干凈，然后用自來水沖干凈，放入恒溫干燥箱內。就是封閉用的，TBST洗用的器具（我用的是培養皿）都要非常認真的清洗，而且每次都要換新的（清洗過沒用過的）培養皿。一抗4度過夜已經足夠了，沒有必要再室溫一小時的。放置的時間較長的話，即使出來熒光，曝光的話，也挺難出現非常漂亮的條帶。還有就是不要把包有膜的保鮮膜放到金屬器具（比如金屬桌子）上，金屬會導致熒光淬滅的。總之，從轉膜完成后的膜接觸過的東西，都要保持干凈，應該說是非常的干凈的。后來的改進方法其實說出來挺可笑的。【1】什么東西都有一個度，不是越長越好的。如果提取的蛋白含的目的蛋白較少的話，可以含蛋白100微克。我每孔上樣20微升，一般能用三次左右（就是說一瓶的細胞夠用3次，也就是說一瓶提取的蛋白可以放到3個孔里）。不知道你的上樣量和蛋白濃度時多少。1：1000，1：2000都試一下。【5】你的二抗是進口分裝的，不知道是分裝的什么公司的。一抗最好用5％的脫脂奶粉稀釋。【4】當然，在摸索抗體濃度的同時，要保證其他步驟的完善、合理性：轉膜成功、封閉的要好、上樣量是否合理（不要太大了）等。【2】如果背景深，考慮二抗濃度高了，可以降低二抗濃度。開始的時候可以把膜剪成幾小塊，每一塊用不同的一抗二抗濃度，這樣就可以比較快的摸出適宜的濃度。蛋白濃度是多少？最好都測一下，因為最大的可能就是蛋白的濃度不夠。【31】為什么做wb時，膜和膠染色怎么都不見條帶，我轉移時是1小時，這已經是第二次了，泡膠時溴酚藍還在膠上，沒有跑到，蛋白應該還在，請高手指導下，實在是太傷心了答：哈，說清楚一點吧，怎么不見條帶呀？有染色嗎？如果考馬斯蘭染色膠都沒有蛋白條帶的話，那染膜當然也是沒有條帶了。【3】麗春紅染色即使洗滌掉了，也會對后面產生影響的。【2】用TBST洗試一下。看上面怎么說，以說明書做參考，然后摸一下適合的比例。上面是1的，配制時可以配成10的，然后應用時再稀釋成1的。我周圍的人也是這樣做的，什么問題也沒有。也不知道這個說法從何而來，有什么依據。【3】先把轉膜搞好，如果轉膜都沒搞好，蛋白都沒有轉到膜上，曝光是很難成功的。因為轉膜是產熱的，而且如果電流較大的話，產熱是相當的大，所以，4度冰箱的降溫效果是不夠的。有人用200毫安，2小時效果也挺好的。【4】必要的時候可以染膜看一下，膜上的蛋白條帶是不是基本一樣的。是不是ECL 液加少了？望各位指教，謝謝！答：【1】是不是每個孔的上樣量不一樣，也就是蛋白的量是否有不同。查一下，你的目的條帶是不是在你的蛋白里含量很低，如果不是，可以通過增加上樣量來提高目的蛋白的量。【27】我做western ，western blotting時沒有條帶，向各位高手請教下如何注意，western blotting能否做出蛋白量很低的小分子蛋白？謝謝！答：【1】分子量到底有多低？一般是可以做出來的，但是小分子量的比較難做的。【26】我是提細胞總蛋白的，6cmdish，我現在是用250ul裂解液的量，可是測出來的蛋白濃度比較低（1ug/ul），提細胞前在顯微鏡下看了細胞長滿了，是不是我的裂解液量加的太多了，應該加多少量比較適合？請教答：【1】哈，可以把裂解液用量調整為50－100微升。可能是一抗二抗的濃度偏高引起的，可以降低一抗二抗的濃度。盡管多克隆抗體一般會出現多條條帶，但看你的這張圖，我感覺不像是多克隆抗體引起的。我用 的是光明牌的脫脂奶粉，效果挺好的。【25】我做western，一抗用的是Cell Signal 的1：1000稀釋（說明書推薦），4度過夜，TBST洗6次（15min/次，怕洗不干凈），二抗1：5000室溫1h，TBST洗4次（10min/次），ECL（PRICE）顯影1min，結果有很多非特異的條帶，請高位高手指點。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。【2】說一下每種物質的作用。現在的情況是：只要說明書上沒寫可以做什么，那基本上是不可以的。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。5 吸去血清，每孔滴加200微升一抗（1：200或1：100，稀釋液為：1%BSA＋%Triton），4攝氏度過夜6 吸去一抗，PBS洗三次，每次5分鐘7 吸去PBS，每孔滴加2～3滴生物素標記的二抗（試劑C，山羊抗兔），室溫下孵育10分鐘8 PBS洗三次，每次5分鐘9 吸去PBS，每孔滴加2～3滴鏈霉素－過氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育10分鐘10 PBS洗三次，每次5分鐘11 吸去PBS，每孔滴加2～3滴新鮮配置的DAB顯色液，反應2～3分鐘后用蒸餾水洗滌，表片后進行脫水透明，步驟為：75％酒精（2分鐘），80％酒精（2分鐘），95％酒精（2分鐘），100％酒精（2分鐘），100％酒精（2分鐘），二甲苯（5分鐘），二甲苯（10分鐘）。[23]. 各位戰友，小弟想請教以下問題，如果某一抗的說明書上的應用范圍只寫明western blot，那我可以用該抗體來做免疫組化嗎？我問過改公司的人，也問過實驗室的老師，他們都說應該可以的，可以拿來試下。【4】你還可以通過提高上樣量的方法來是目的條帶增粗。一般加裂解液的量是可以根據需要調節的。【2】你可以先把細胞從培養皿中取出來。濃縮和變成凍干粉的方法除外。你可以考馬斯蘭染色看一下蛋白條帶的情況。這樣膠凝固的快一點，不容易收縮。這樣膠的效果很好，用肉眼是看不出濃縮膠收縮的。這是膠的配方有問題？還是電泳液有問題？希望各位多多指教！答：1】經常看到說濃縮膠會收縮的帖子，估計這和梳子的插法有一定的關系。【5】轉膜過后，所有接觸到膜的器具都要保持清潔。封閉結束后可以直接加入一抗。我是4度搖床一抗孵育過夜的。我是用5％脫脂奶粉搖床上室溫封閉4小時，效果挺好的。如果膜上的蛋白很清楚就在轉膜后找原因。不知道你的上樣量和蛋白濃度時多少。【4】TBST 洗滌時用的器具要干凈。一抗最好用5％的脫脂奶粉稀釋。[19].western blot 整個膜上都是熒光，特異條帶沒有，怎么回事？答？【1】最可能的原因就是封閉的不夠。問題3：最后顯影時發現膠片上的條帶都是連在一起的，重復幾次還是這樣的結果，真是急死了，都不知道是什么原因造成的，請各位戰友幫幫忙呀! 回答：（1）上樣量太大，或者蛋白濃度過高。我把空白對照、標準、待測蛋白同時加入96孔板中，在酶標儀的CURVE這一項中，設置曲線，然后讀結果，就可以直接測出待測蛋白的蛋白濃度，當然標準曲線同時可以測出。請問各位戰友，？怎么樣才能測得準？回答：，難度太大了，我是肯定達不到。期間可以加用超聲組織。回答：本質上是一樣的。【6】增加在ECL中的時間。【4】一抗孵育后的洗膜，有有利的一面，也有不利的一面。【2】增加一抗的孵育時間。如果你的目的蛋白表達低的話，也可以增加上樣量。【3】如果分子量很小的話，可以不用跑的那么久，一般跑到膠的1/3－2/3就可以了。但mark還是只跑出三條帶是怎么回事，而且每次下面都有粗粗的帶，是溴酚蘭嗎?請大家給分析下，到底怎樣才能跑出完整的marker帶？ 答：【1】注意看電泳液是不是有問題：配錯了？過期了？MARKER一般都對膠都有一定的要求，也就是說它一般只適用一定范圍的膠，不是所有的膠都適合的。不知道你的上樣量和蛋白濃度時多少。【3】TBST 洗滌時用的器具要干凈。你的一小時似乎有些短了。可以考慮增加一抗的濃度，一抗用5％的脫脂奶粉配制。如果沒有降解，可以適當減少裂解液的用量，這樣就可以增加蛋白濃度了。【3】你的蛋白濃度一般是2ug/uL左右。 【2】不知道你裂解的時候是否加了蛋白酶抑制劑，可以加PMSF的。我不提倡轉膜過夜的，感覺這就是簡單問題復雜化，25分鐘就能解決的問題，干嘛非要浪費一晚上[14]. 我做WB快3個月了,內參能做出來,暗室下能看到很明顯的熒光條帶,但是目標蛋白一直沒從出現過影子,該怎么辦?我的目標蛋白54KD,內參是actin,很細較弱,轉膜后麗春紅染膜,整條泳道一片紅,但是條帶很少,只有幾條,內參條帶很明顯,請大家幫忙分析分析,謝謝!,蛋白濃度一般是2ug/uL左右,上樣量30ug/,每孔只能上樣20uL.,35min,Biorad半干轉%脫脂牛奶封閉RT,1h。有些人沒這么做，曝光的條帶也挺好的）。【5】我的電泳液一般只有2次，不用第三次。從這可以看出，轉膜的條件限制的不是很嚴格的，有很大的浮動度。其實我也懷疑，但這是事實。【3】現在我的一同學用300毫安半小時轉膜，分子量分別為27和32KD，效果挺好的。我買過兩種MARKER，晶美的預染MARKER 就很好，條帶很清楚。就出現了樓主所說的情況。也就是說，如果上樣緩沖液出了問題的話，決定蛋白泳動速度的就和蛋白的分子量和蛋白的帶電價兩者有關。我先說一下上樣緩沖液。和上面的照片很象的。早期只要MARKER條帶分開了，就可以數所有的MARKER條帶，一般會找到的。不同的濃度的膠會對MARKER產生影響的。右邊那張圖的最下面一個條帶已經很淡了，提示散開了，也就是說如果減少電泳時間的話，下面的條帶很有可能出來的。marker是新買的，和同學一人一支，他跑8％的膠，分子量100多的，跑的時候和我不一樣，看不了條帶。又或者是不是marker有問題？原來懷疑tris－cl PH的問題，測了一下，果然不大準，第二次就換了同學在用的，結果還是這樣。下面是膜上的marker條帶，基本和膠上是對應的，濃度也差不多。【4】而想把兩者曝光曝出來，用我上面帖子中的方法就可以了。下面是不同分子量蛋白的適用膠的選擇。哈，這樣是當然