植物細胞工程制藥-文庫吧

【正文】 生長素 和 分裂素 的比例： ? 高濃度生長素和低濃度分裂素 —— 刺激細胞 分裂 ? 低濃度生長素和高濃度分裂素 —— 刺激細胞 生長 ? （三）誘導子 (elicitor)： 刺激植物細胞合成 防御性次生代謝產物 的物質 , 可以通過改變次生代謝途徑中催化酶的 酶活力 ,引起代謝通量和反應速率的改變 , 提高次生代謝產物的產量。 ? 非生物誘導子 ：水楊酸，茉莉酸等 ,稀土及重金 屬鹽類 ? 生物誘導子 ：微生物類，如真菌孢子，菌絲體 真菌培養物濾液等 ? （四）碳源 細胞培養過程中不進行光合作用，需提供糖做碳源。 ? （五） 維生素：煙酸， B1， B6 ? （六）有機物：甘氨酸或水解絡蛋白，酵母提取 液等。 三、植物細胞生物反應器 ? 植物細胞易聚集化，比較脆弱，代謝途徑和代謝產物累積與細胞生長關系的復雜性，選擇合適的培養方法和反應器影像產物產量 ? 細胞培養周期長，次生代謝產物含量相對較低，提取困難，生物反應器技術還有待深入 各種生物反應器性能比較 ? 不同類型的生物反應器各有其優缺點，而改進的攪拌式生物反應器和氣升式反應器可能更適合植物細胞的培養。 ? 一般來說，懸浮培養的細胞在干重不大于 20g/L時，以氣升式反應器為宜，而當干重超過 20g/L時，則改進的攪拌式生物反應器優于其它類型的反應器 ? 我國發明的 “ 氣升內錯流 ” 式植物細胞培養反應器，能夠適應植物細胞培養周期長，培養液隨培養進程而蒸發減少的生物反應過程；可抑制氣泡的聚合，減弱氣泡在液面破裂時產生的沖擊力對細胞的損傷；可提高降液區氣含率，消除降液區缺氧現象，并強化混合與氧傳遞，大大降低反應器高度。 ? 使用這種反應器培養新疆紫草細胞，培養結束時細胞量達到 12gdw／ L，紫草寧含量達到了細胞干重的 10％，是天然植株含量的 2～ 8倍 四、植物細胞的獲得和擴大培養 （一）植物細胞的獲得 ? 法 :機械切割、組織破碎直接從植物外植體中分離 ? 法：從愈傷組織制備小細胞團或單細胞懸液 ? 法： 纖維素和果膠酶 混合處理外植體或愈傷組織，分離原生質體，再生培養基中培養，原生質體細胞壁再生獲得植物細胞 （二）植物細胞的培養方法 ? （ 1） 看護培養法 （ nurse culture） ：在單細胞的生長環境里加入愈傷組織同時培養。愈傷組織提供促細胞分裂的物質等，傳遞生物信息，使持續分裂增值等。 ? 即愈傷組織看護單細胞 ? （ 2） 微室培養法 ：單細胞接種到小室里，密封培養，觀測單細胞的生長發育情況 ? （ 3） 平板培養法 ：單細胞接種于固體培養基上，獲得單細胞形成的細胞系 ? （ 4） 條件培養法 ：接種于條件培養基上形成的細胞系。條件培養基指培養過細胞的培養基上清，有植物生長激素等殘留，用于制備成固體培養基。 （花藥培養）：指將植物單倍體細胞培養成單倍體植株或純和二倍體植株 ? 一般采取花藥作為單倍體細胞的培養對象 ? 用花粉在固體培養基上培養 ? 愈傷組織既是組織又是細胞，為脫分化細胞，具再分化的能力，可用于次生代謝物的生產，也可再生為植株。 ? 一些次生代謝產物只有在根里生長 ? 發根農桿菌感染雙子夜植物， RI質粒誘導產生毛狀根。 ? 形態方面： Ri質粒誘導快速生長的、非定向性、高分支的毛狀根的形成 ? 代謝方面： Ri質粒轉化根能合成與原植物相同或相似的次生代謝物，并且發根合成次生代謝物具有遺傳穩定性。 ? 毛狀根生長快速和次級代謝產物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養的植物中得到較高含量的次級代謝產物。 ? 毛狀根具有如下特點： ? 激素自養 ，不必加外源激素； ? 次級代謝產物含量 高 且 穩定 ； ? 增殖速度 快 。 ? 用 發根農桿菌經 直接注射法，外植體接種感染，原生質體共培養法誘導毛狀根 ? 發根農桿菌轉化后，經篩選鑒定 ? 低鹽濃度下生長，培養 植物細胞培養工業化存在的問題 ? 生長緩慢 ,通常完成一次生產周期需 45周 ? 次級代謝物含量低 ? 培養細胞不穩定等 ? 多數產物積累于胞內 ? 不耐受剪切力 ? 一般的說，只有當次級代謝產物的價格高于 1000美元 /kg時，才考慮采用植物細胞培養方法。 第三節 轉基因植物 一、轉基因植物的產生和發展 （一）轉基因植物的基本概念 ? 轉基因植物： 遺傳修飾體 (geically modified anisms, GMOs) ? 近年發展迅速 ? 應用廣泛 ? 世界第一例轉基因植物 煙草 1983年在美國問世。 ? 1986年 ,首批轉基因植物 抗蟲和抗除草劑棉花進入田間試驗。 ? 1992年中國成為世界上第一個轉基因植物商品化種植的國家，開創了轉基因植物商品化應用的先河；當時種植的是一種抗黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒雙價轉基因煙草。 （二）轉基因植物的幾大類型 ? :除草作用的酶和蛋白質基因 。以除草劑為底物的酶的基因轉移 ? :從細菌中、植物組織中和動物體內分離出相關抗性基因 ,轉入植物中 ? ? :抗旱、抗寒、抗熱和抗鹽 ? ? ? 二、轉基因植物技術原理和方法 （一）基因獲得 ? （ 1）氨基酸序列反推核酸序列，合成探針，從基因組或 cDNA文庫中篩選 ? 利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。 ? 雖然在早期采用這種方式已經成功地克隆了許多基因。 ? 局限性：兼并密碼子 。 效率低 。 未知基因及產物 分離蛋白質 明確氨基酸序列 推導核苷酸序列 人工合成 ? （ 2）分離蛋白，制備抗體，用抗體從 cDNA表達文庫中篩選 ? （ 3）根據數據庫信息，利用保守區域制備 PCR引物，進行擴增 ? （ 4）以其他物種的類似基因為探針，雜交分離相應基因 （二）外源基因導入 是目前植物基因工程中使用最多、機理最清楚、技術最成熟的、最重要的一種轉化系統 Tumor induced by A. tumefaciens 冠癭瘤 ? 過程：先將帶有目的基因的質粒整合到農桿菌基因組中，再將此農桿菌與植物細胞共同培養 36～48h，轉化植物細胞，然后分離洗滌去菌后通過組織培養獲得轉基因植物或形成 冠癭瘤 和發狀根等組織，這些組織也就是一種天然的選擇標記。 (1)根癌農桿菌 轉化系統。 含有 Ti質