免疫學及免疫學檢驗標記技術-文庫吧

【正文】 原的另一抗原決定簇結合 ,形成固相抗體 抗原 標記抗體復合物 ,洗棄反應液中剩余的標記抗體 ,測定固相上的放射性。 免疫學及免疫學檢驗 免疫學及免疫學檢驗 IRMA與 RIA的異同點 ? 標記物 在 RIA中 核素標記抗原，抗原有不同種類，根據其化學結構，標記時需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中 核素標記抗體?？贵w為蛋白質，有利于碘化標記，不同抗體標記方法基本相同。標記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。 ? 反應速率 反應速度與反應物的濃度呈正比，在 IRMA中標記抗體是過量的，而且不存在競爭性結合復雜的反應，所以反應速度較 RIA快。在 RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在 IRMA中應用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結果。 免疫學及免疫學檢驗 ? 反應原理 RIA為競爭抑制，測得放射性的量與受檢抗原呈反比。 IRMA為非競爭結合，劑量反應曲線為正相關的直線關系。 ? 特異性 在雙位點 IRMA中，一般均應用針對不同位點的單克隆抗體，其交叉反應率低于應用多克隆抗體的RIA。 ? 檢測范圍 通常 RIA的工作范圍為 23個數量級，而RIMA可達 3個數量級以上。 免疫學及免疫學檢驗 ? 分析誤差 RIA中加入的抗體和標記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴重影響測定結果。 IRMA中標記和固相抗體在反應中都是過量的，只有受檢標本的加樣誤差才會影響分析結果。因此， IRMA的批內和批間變異均比較小。 ? 其他 RIA可以測定大分子量與小分子量的物質，雙位點IRMA只能測定在分子上具有 2個以上抗原表位的物質。在RIA中應用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量很少。 IRMA中標記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來源豐富、特異性較高的單克隆抗體。 免疫學及免疫學檢驗 放射免疫技術的應用 常用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標志物和藥物等微量物質的測定。 問題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩定期不長不易自動化儀器分析等。 免疫學及免疫學檢驗 第九章 免疫熒光技術 免疫熒光技術 (immunofluorescence technique)是標記免疫技術中發展最早的一種。 是將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種方法。 免疫學及免疫學檢驗 基本原理 利用熒光素標記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標本中的待檢抗原特異結合，采用高發光效率的點光源，透過濾色板發出一定波長的光，使結合在標本上的熒光素被激發而產生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態，來判斷有無待檢抗原或抗體。 免疫學及免疫學檢驗 第一節 熒光的基本知識 免疫學及免疫學檢驗 異硫氰酸熒光素（ FITC） 為黃色或橙黃色結晶粉末，分子量為 ，最大吸收光波長為 490495nm，最大發射光波長 520530nm，呈現明亮的 黃綠色熒光 ，是應用最廣泛的熒光素。 主要優點：①人眼對黃綠色較為敏感；②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色， 降低背景干擾 。 免疫學及免疫學檢驗 免疫學及免疫學檢驗 四乙基羅丹明（ RB200） 為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩定，可長期保存。最大吸收光波長為 570nm，最大發射光波長為 595－ 600nm，呈橘紅色熒光 。常用于雙重標記或對比染色。 免疫學及免疫學檢驗 四甲基異硫氰酸羅丹明（ TRITC） 最大吸引光波長為 550nm，最大發射光波長為 620nm，呈 橙紅色熒光 。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。 免疫學及免疫學檢驗 熒光分子的輻射能力在受到激發光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，一些化合物對熒光有猝滅作用，因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。 免疫學及免疫學檢驗 熒光抗體的制備 作為標記的熒光素應符合以下要求 ： ①應具有能與蛋白質分子形成共價健的化學基團，與蛋白質結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產物易于清除。 ②熒光效率高 ,與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率。 ③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。 ④與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質，與蛋白質的結合物穩定，易于保存。 ⑤標記方法簡單、安全無毒。 免疫學及免疫學檢驗 熒光抗體是將熒光素（如 FITC）與特異性抗體以化學方式共價結合而成。 標記方法：攪拌法 (適合大樣品 ) 透析法 (適合小樣品 ) 標記抗體的純化：透析法 層析分離法 免疫學及免疫學檢驗 熒光抗體的鑒定 F/P比率 ： 將制備的熒光抗體稀釋至 A280≈ ，分別測讀 A280（蛋白質特異吸收峰）和標記熒光素的特異吸收峰 免疫學及免疫學檢驗 F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標本的熒光抗體以 F/P＝ ，用于活細胞染色的以 F/P＝ 。 免疫學及免疫學檢驗 抗體效價 ：效價越大標記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在 1:161:32者較為理想 抗體特異性 ：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉