微生物實驗室操作指導(已修改)

　

【正文】 34微生物實驗室操作指導書（受控）微生物實驗室操作指導書目錄（一）安全守則（二）檢驗總則（三）基本技術要求（四）食品平板菌落計數（五）食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法（六）沙門氏菌檢驗（七）金黃色葡萄球菌檢驗（八）霉菌計數（九）革蘭氏染色（十）空氣中微生物的檢驗（十一） 水中微生物的檢驗（十二）食品接觸面的微生物檢驗（十三）蔬菜農殘的快速檢測審核：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　編制： （一）安全守則1 進入實驗室工作衣、帽、鞋必須穿戴整齊。2 在進行高壓、干燥、消毒等工作時，工作人員不得擅自離開現場，認真觀察溫度、時間，蒸餾易揮發、易燃液體時，不準直接加熱，應置水浴鍋上進行。3 嚴禁用口直接吸取藥品和菌液，按無菌操作進行，如發生菌液、病原體濺出容器外時，應立即用有效消毒劑進行徹底消毒，安全處理后方能離開現場。4 工作完畢，兩手用清水肥皂洗凈，必要時可用（殺菌劑）新潔爾滅、過氧乙酸液浸泡手，然后用水沖洗，工作服應經常清洗，保持整潔，必要時高壓消毒。5 實驗完畢，及時清理現場和實驗用具，對染菌帶毒物品，進行消毒滅菌處理，并填寫日常工作記錄。6 每日下班，認真檢查水、相關電源是否關閉和正在使用的設備運轉是否正常，并認真記錄。下班前關好門窗，方可離去。（二）檢驗總則1 主題內容與適用范圍　本文規定了微生物檢驗一般規則。本文適用于食品中微生物學檢驗的采樣、檢驗及結果報告。2 樣品的采集 采樣目的確保采集的樣品能代表全部被檢驗的物質，使檢驗分析更具代表性。 采樣原則 采集的樣品要有代表性，采樣時應首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環境衛生狀況等進行詳細調查，檢查是否有污染源存在，同時能反映全部被檢食品的組成、質量和衛生狀況。 應設法保持樣品原有微生物狀況，在進行檢驗前不得污染，不發生變化。 采樣必須遵循無菌操作程，容器必須滅菌，避免環境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新潔爾滅、酒精等消毒物滅菌，更不能含有此類消毒藥物，以避免殺掉樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可使用。 采樣數量取樣數量的確定，應考慮分析項目的要求、分析方法的要求及被檢物的均勻程度三個因素。樣品應一式三份，分別供檢驗、復檢及備查使用，每份樣品數量一般不少于200g。根據不同種類采樣數量略有不同，實驗室檢驗樣品一般為25克。 采樣方法 采取隨機抽樣的方式。 直接食用的小包裝食品，盡可能取原包裝，直到檢驗前不要開封，以防污染。 如為非冷藏易腐食品，應迅速將所采樣品冷卻至0－4℃。 不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細菌增殖。 在將冷凍食品送到實驗室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。 樣品的保存和運送 樣品采集完后，應迅速送往實驗室檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1－5℃環境中，如需冷凍者，則在冷凍狀態下送檢。 冷凍樣品應存放在－15℃以下冰箱內；冷卻和易腐食品應存放在0－5℃冰箱或冷卻庫內；其它食品可放在常溫冷暗處。 運送冷凍和易腐食品應在包裝容器內加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。 待檢樣品存放時間一般不應超過36小時。3 檢驗樣品的制備 樣品的全部制備過程均應遵循無菌操作程序。 檢驗冷凍樣品前應先使其融化。可在0－4℃融化，時間不超過18小時，也可在溫度不超過45℃的環境中融化，時間不超過15分鐘。 檢驗液體或半固體樣品前應先將其充分搖勻。如容器已裝滿，可迅速翻轉25次；如未裝滿，可于7s內以30cm的幅度搖動25次。從混樣到檢驗間隔時間不應超過3分鐘。 開啟樣品包裝前，先將表面擦干凈，然后用75％乙醇消毒開啟部位及其周圍。 非粘性液體樣品可用吸管吸取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養基內，,也不得將吸有樣品的吸管浸入稀釋液或培養基內。 粘性液體樣品可用滅菌容器稱取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養基。 固體或半固體樣品可用滅菌的均質杯稱取一定量，再加適量的稀釋液或培養基進行均質，從樣品的均質到稀釋和接種，相隔時間不應超過15分鐘。4 檢驗 實驗室收到樣品后，首先進行外觀檢驗，及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗，檢驗過程中要認真、負責，嚴格進行無菌操作，避免環境中微生物污染。 檢驗所使用的稀釋液、試劑、培養基接觸的一切器皿必須經過有效的滅菌。 實驗室所用儀器、設備的性能應定期檢查和校正。 制備試劑和培養基所用的水，應為無離子水或用玻璃器皿蒸餾的蒸餾水。 檢驗結束后，所有帶菌的培養基、試劑、稀釋液和器皿必須盡快滅菌和洗刷。清洗過的器皿不應殘留洗滌劑的痕跡。5 檢驗記錄和結果的報告 經檢驗的每份樣品都應有完整的檢驗記錄。樣品檢驗過程中所用方法、出現的現象和結果等均要用文字寫出試驗記錄，以作為對結果分析、判定的依據，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。 檢驗結束后，根據檢驗結果，及時填寫檢驗報告書，簽字并經負責人審核簽字后發出。（三）基本技術要求1 無菌操作要求微生物實驗室工作人員，必須有嚴格的無菌觀念，許多實驗要求在無菌的條件下進行，主要原因，一是防止試驗操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染。要求如下： 接種細菌時必須穿工作服、帶工作帽； 進行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應放在無菌室緩沖間，工作前經紫外線消毒后使用； 接種食品樣品時，應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球將手擦干凈； 進行接種所用的吸管、平皿及培養基等必須經消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用酒精點燃燒灼三次后使用； 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及試管或平皿邊； 接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌活樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒； 接種環和針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到針和環與桿的連接處，接種結核菌和烈性菌的接種環應在沸水中煮沸5min,再經火焰燒灼； 吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。2 無菌間使用要求 無菌間應密封，不得隨意打開，并設有與無菌間大小相應的緩沖間及門，另盡量設有的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。 無菌間應保持清潔，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與試驗無關的物品。 無菌間使用前后應將門關緊，打開紫外燈，如采用室內懸掉紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離工作臺1m處，照射時間不少于30分鐘，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭，除去上面的灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。 處理和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。 在無菌間需用安裝空調時，則應有過濾裝置。3 消毒滅菌要求微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養基、被污染和接種的培養物等，必須經滅菌后方能使用。 滅菌前準備 所有需經滅菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應將上面氣孔打開。 裝培養基的三角瓶塞好棉塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。 裝放 大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品不應超過鍋內容積的80%，物品應放置鍋內擱架上或鐵絲筐中。 手提式高壓鍋：將物品分別包扎好，直接放入消毒筒內，物品之間不能過擠。 設備檢查 檢查門的開關是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。 壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。 對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應檢查規定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。 滅菌處理手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應按下列步驟進行： 手提式高壓鍋在主體內加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復使用時應將水量補足，水變混濁需要更換）。 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放出冷氣（水沸騰后排氣10～15min）。 關閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規定要求，并維持規定時間（按滅菌物品性質與有關情況而定）。 達到規定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸汽，待壓力恢復到零時，自然冷卻至60℃后開蓋