微生物實(shí)驗(yàn)室操作指導(dǎo)-資料下載頁

　　

【正文】 （十）空氣中微生物的檢驗(yàn)1 目的了解空氣中微生物的狀況，掌握空氣中微生物的檢驗(yàn)方法，分析引起食品中微生物的來源因素，及時(shí)控制餐食衛(wèi)生質(zhì)量。2 原理根據(jù)空氣中微生物一般吸附在塵埃中，由于地心引力塵埃下沉到地面或物體表面原理制定的。3 器材培養(yǎng)皿、生化培養(yǎng)箱、營養(yǎng)瓊脂4 方法（沉降法） 以無菌操作將已融化并冷卻至50℃的營養(yǎng)瓊脂倒入培養(yǎng)皿中，放置凝固。 在不同地點(diǎn)將培養(yǎng)皿分別打開，在空氣中暴露15分鐘，立即將培養(yǎng)皿蓋好，作上記號(hào)，并作一空白對(duì)照。 將培養(yǎng)皿放置37℃恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，取出觀察其結(jié)果并計(jì)算出菌落數(shù)。 計(jì)算公式：每立方米空氣中細(xì)菌數(shù)＝50000N/(At)N：為培養(yǎng)皿經(jīng)培養(yǎng)后的菌落數(shù)A：為所用平皿面積(cm2)，平皿直徑(248。)9cmt：為平皿暴露于空氣中的時(shí)間(t=15分鐘)（這個(gè)公式根據(jù)：根據(jù)15分鐘內(nèi)在100 cm2面積上降落的細(xì)菌數(shù)約等于10升空氣中的含菌數(shù)而估計(jì)的。）注：本文參照GB159792002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》附錄E（十一） 水中微生物的檢驗(yàn)1 基本原理細(xì)菌總數(shù)是指水樣在一定條件下培養(yǎng)后所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)。總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，具有指示菌的一般特征，故以此作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)飲水的衛(wèi)生質(zhì)量。水中總大腸菌群數(shù)系以100ml水樣中污染的總大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。按國家飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，1毫升自來水中雜菌數(shù)不得超過100個(gè)，大腸菌群數(shù)1000毫升水中不得超過3個(gè)才算合格。2 材料營養(yǎng)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、酒精、棉簽、培養(yǎng)皿、無菌廣口瓶3 方法 采樣（自來水）：先將水龍頭打開，放水1~2分鐘后，關(guān)閉水龍頭。用酒精棉球灼燒龍頭三分鐘滅菌，再開放水龍頭使水流5分鐘，用無菌瓶收集水樣。 細(xì)菌總數(shù)檢查： 用滅菌吸管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中，共做2個(gè)。 分別傾注約15ml已熔化冷卻至45℃左右的營養(yǎng)瓊脂，混勻后置37℃培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，同時(shí)應(yīng)作一空白對(duì)照。兩個(gè)培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)即為水樣1ml中的細(xì)菌總數(shù)。 大腸菌群數(shù)檢查：　　乳糖發(fā)酵試驗(yàn)→分離培養(yǎng)→證實(shí)試驗(yàn)→報(bào)告 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：自來水的接種方法：在2個(gè)裝有50ml三倍料乳糖膽鹽發(fā)酵液的三角瓶中，各加入100ml水樣；在10支裝有5ml同樣發(fā)酵的試管中，各加入10ml水樣，混勻。將上述各發(fā)酵管（瓶）置36177。1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24177。2小時(shí)，觀察結(jié)果。如所有發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。 分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管用接種環(huán)分別以劃線法轉(zhuǎn)接于伊紅美蘭瓊脂平板上，置36177。1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18~24小時(shí)，取出觀察菌落形態(tài)。 證實(shí)試驗(yàn)：在每個(gè)平板上，挑取可疑菌落(紫黑色或淡紫紅色，有或略有或沒有金屬光澤的菌落)1~2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36177。1℃培養(yǎng)24177。2小時(shí)進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的芽孢桿菌即可報(bào)告為大腸菌群陽性。4 報(bào)告每毫升自來水所含菌落數(shù)以個(gè)/mL表示；根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查大腸菌群檢索表，報(bào)告每升水樣的大腸菌群的最可能數(shù)。注：本文參照GB575085《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》（十二）食品接觸面的微生物檢驗(yàn)1 原理食品接觸面分為人員手、設(shè)備、器具等食品直接接觸，其表面存在有微生物，為更好控制微生物生長繁殖，以大腸菌群為主要檢測指標(biāo)，檢測結(jié)果應(yīng)基本呈陰性（其中人員手需做菌落總數(shù)檢測）。2 檢驗(yàn)材料　乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、EMB、乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基、大腸菌群檢測紙片、無菌棉球、無菌水、酒精棉球、酒精燈、鑷子　3 檢驗(yàn)方法 人員手檢驗(yàn)（發(fā)酵法） 樣品采集被檢人雙手五指并攏，用一浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10ml滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)。 細(xì)菌菌落總數(shù)的檢測將已采集的樣品在6h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，每支采樣管充分混勻后取1ml樣液，放入滅菌平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)樣品平行接種兩塊平皿，置36177。1℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)平板上細(xì)菌菌落數(shù)。Y＝A*10（Y為工人手表面細(xì)菌菌落總數(shù)，cfu/只手；A為平板上平均細(xì)菌菌落數(shù)） 大腸菌群的檢測每支采樣管充分混勻后取1ml樣液，分別放入10ml乳糖膽鹽發(fā)酵管中，每個(gè)樣品平行接種3管，置36177。1℃培養(yǎng)24小時(shí)。如所有發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。 分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管用接種環(huán)分別以劃線法轉(zhuǎn)接于伊紅美蘭瓊脂平板上，置36177。1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18~24小時(shí)，取出觀察菌落形態(tài)。 證實(shí)試驗(yàn)：在每個(gè)平板上，挑取可疑菌落(紫黑色或淡紫紅色，有或略有或沒有金屬光澤的菌落)1~2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36177。1℃培養(yǎng)24177。2小時(shí)進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的芽孢桿菌即可報(bào)告為大腸菌群陽性。 設(shè)備、器具等的檢驗(yàn)（紙片法） 將面積為25cm2的大腸菌群檢測紙片用無菌水浸濕后立即貼于被檢物表面，每份檢樣貼2張，30s后取下，置于無菌塑料袋中。 將已采樣的紙片置37℃培養(yǎng)16－18小時(shí)，觀察紙片顏色變化情況。 若紙片保持藍(lán)紫色不變?yōu)榇竽c菌群陰性，紙片變黃并在黃色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)或片狀紅暈為陽性。4 報(bào)告人員手菌落總數(shù)為cfu/只手，大腸菌群為未檢出或檢出；設(shè)備、器具等大腸菌群為未檢出或檢出。　注：本文參照GB159792002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》附錄EGB14934—94《食(飲)具消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（十三）蔬菜農(nóng)殘的快速檢測1 原理農(nóng)殘速測卡是用對(duì)農(nóng)藥高度敏感的膽堿酯酶和顯色劑做成的酶試紙，可以快速檢測蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯這兩類用量較大、毒性較高的殺蟲劑的殘留情況，選用的酶對(duì)甲胺磷敏感，抗干擾性強(qiáng)，操作簡便。該方法已經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)通過，定為國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/。農(nóng)殘速測卡對(duì)幾種常用農(nóng)藥的最低檢測限（單位：mg/kg）如下： 2 檢驗(yàn)材料　農(nóng)殘速測卡　3 使用方法 整體測定法 選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10ml純凈水或緩沖溶液，振搖50次，靜置2min以上。 取一片速測卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37℃恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。 將速測卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。 每批測定應(yīng)設(shè)一個(gè)純凈水或緩沖液的空白對(duì)照卡。 表面測定法（粗篩法） 擦去蔬菜表面泥土，滴23滴洗脫液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。 取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。 放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37℃恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。 將速測卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。 每批測定應(yīng)設(shè)一個(gè)純凈水或緩沖液的空白對(duì)照卡。4 結(jié)果判定與空白對(duì)照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽性結(jié)果，不變藍(lán)為強(qiáng)陽性結(jié)果，說明農(nóng)藥殘留量較高，顯淺藍(lán)色為弱陽性結(jié)果，說明農(nóng)藥殘留量相對(duì)較低。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對(duì)照卡相同，為陰性結(jié)果。對(duì)陽性結(jié)果的樣品，可用其它分析方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。5 附加說明 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、皎白、蘑菇及番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測定法。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。 當(dāng)溫度條件低于37℃，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長，延長時(shí)間的確定，應(yīng)以空白對(duì)照卡用（體溫）手指捏3分鐘時(shí)可以變藍(lán)，即可往下操作。注意樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照卡放置的時(shí)間一致才有可比性。空白對(duì)照卡不變色的原因：一是藥片表面緩沖溶液加的少、預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤，二是溫度太低。 速測卡對(duì)農(nóng)藥非常敏感，測定時(shí)如果附近噴灑農(nóng)藥或使用衛(wèi)生殺蟲劑，以及操作者和器皿沾有微量農(nóng)藥，都會(huì)造成對(duì)照和測定藥片不變藍(lán)。 紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)的時(shí)間以3min為準(zhǔn)，3min后藍(lán)色會(huì)逐漸加深，24h后顏色會(huì)逐漸退去。修訂　1　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 2006－09－01