細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊-wenkub

　

【正文】 細(xì)胞為扁平橢圓形，中央有橢圓形核，染成蘭色。圖1—1血涂片的制備 5．人血涂片的制備與觀察 取人血一滴，制片方法同上。(圖l一1)。染色用甲基蘭。盡可能拉直肌纖維。在壓片上滴一滴甲苯胺蘭染液，染色10分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。 (二)觀察方法與結(jié)果 1．制備蟾蜍脊髓壓片觀察脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞。例如：具有收縮機(jī)能的肌細(xì)胞伸展為細(xì)長形；具有感受刺激和傳導(dǎo)沖動機(jī)能的神經(jīng)細(xì)胞有長短不一的樹枝狀突起；游離的血細(xì)胞為圓形、橢圓形或圓餅形。【實(shí)驗(yàn)用品】一、材料和標(biāo)本 蟾蜍一只，人血液一滴。 三、各部結(jié)構(gòu)名稱要在一側(cè)引直線注明。 6．鈍頭鑷子：用于提取臟器、組織等。 3．大剪刀：用于剪毛、皮膚、皮下組織和肌肉等。常用來搗髓處死蟾蜍，持法如執(zhí)筆法。角刺穿腹部肌肉而進(jìn)入腹腔(刺穿腹肌時(shí)有一落空感)。頸椎脫位法的具體方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的頭部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其頸椎脫位而立即死亡。用左手的拇指和食指抓住其頭頂部皮膚，然后用左手小指與手掌之間夾住其尾巴。然后將解剖針抽回并轉(zhuǎn)向尾側(cè)刺入脊椎管內(nèi)搗毀其脊髓。 1．雌雄鑒別 通常雄性蟾蜍較雌性的為小，且在其前肢的l～3趾基部有被稱為婚墊的黑疣。例如，蟾蜍可以用于觀察離體心臟搏動情況的實(shí)驗(yàn)，小白鼠常用于樣本很大的實(shí)驗(yàn)(如藥物的半數(shù)致死量的測定等)，貓常用于測定腦內(nèi)電位的實(shí)驗(yàn)，而狗是局解手術(shù)中常用的實(shí)驗(yàn)動物。 八、動物尸體、紙片及實(shí)驗(yàn)廢物應(yīng)放到指定地點(diǎn)，不得隨意亂丟。 六、注意節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料、藥品和水、電等。 五、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各組儀器及器材由各組自已使用，不得互相調(diào)換。 二、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之前要換好白大衣及拖鞋。現(xiàn)在第四版在1993年第三版基礎(chǔ)上對部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了補(bǔ)充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的顯示”實(shí)驗(yàn)。 全書內(nèi)容共23個實(shí)驗(yàn)，五年制本科、七年制醫(yī)學(xué)專業(yè)和研究生班教學(xué)根據(jù)具體情況選擇基本實(shí)驗(yàn)，由學(xué)生自己動手操作，少數(shù)應(yīng)用大型精密儀器的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行參觀示教，另附實(shí)驗(yàn)報(bào)告一冊。 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)目的，主要是通過基本技能訓(xùn)練以及觀察分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使學(xué)生了解并掌握有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和操作方法，進(jìn)而培養(yǎng)學(xué)生動手實(shí)踐、觀察分析和解決問題的能力。為達(dá)到此目的，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容自成體系，著眼于加強(qiáng)學(xué)生的基末技能訓(xùn)練，以及觀察分析問題和科學(xué)思維能力的培養(yǎng)。 本教材由王蕓慶主編、謝榮林副主編，參加編寫的有陳興、謝榮林、寧剛、劉冬杰、黃東陽、紀(jì)曉輝、時(shí)偉紅、朱亞勤、黃集前、王明武、畢衛(wèi)真、張婕、三維琴和王世藩。由于經(jīng)驗(yàn)不足，水平有限，本教材一定還有很多缺點(diǎn)和錯誤，敬請使用者批評指正。 三、保持實(shí)驗(yàn)室安靜，不許在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大聲喧嘩及隨意走動。要愛護(hù)儀器、標(biāo)本和設(shè) 備。 七、保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清潔整齊。九、有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實(shí)驗(yàn)，并取消其當(dāng)堂實(shí)驗(yàn)成績。 在我們細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，除應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞外，最常用的動物是蟾蜍和小白鼠，下面對其特點(diǎn)及基本處置做一簡單的介紹。 2．捉拿及處死方法： 常用搗髓法處死蟾蜍，即用解剖針搗毀其腦組織和脊髓。如此直至其四肢松軟，呼吸消失為止。 2．處死方法： 處死應(yīng)以安樂死為原則，即使之無痛苦而迅速死亡。 3．給藥方法： 小自鼠的給藥途徑有經(jīng)口給藥、腹腔內(nèi)注射、尾靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和肌肉注射等。針頭刺入腹腔后切勿左右擺動，以免損傷腸管或肝臟。 2．解剖刀(即外科手術(shù)刀)：用于各種皮膚切口和組織切除等。持法如圖。 7．有鉤鑷子：用于提取皮膚切口等。各引線要平行不得交叉。 二、器材和儀器 配有目鏡測微尺的顯微鏡一臺、載片十張、蓋片三張、吸水紙、手術(shù)器材一套、解剖盤一個、鏡臺測微尺一個、小平皿一個、牙簽。 不論細(xì)胞的形狀如何，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)一般分為三大部分：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。 取蟾蜍一只，破壞腦和脊髓，在口裂處剪去頭部，除去延腦，剪開椎管，可見乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿內(nèi)，用Ringer氏液洗去血液后放在載片上，剪碎。在顯微鏡下觀察，染色較深的小細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在顯微鏡下觀察，肌細(xì)胞為細(xì)長形，可見折光不同的橫紋，每個肌細(xì)胞有多個核，分布于細(xì)胞的周邊(參照照片)。顯微鏡下觀察可見肝細(xì)胞核染成蘭色，肝細(xì)胞緊密排列，擠成多角形(參照照片)。晾干。顯微鏡觀察可見人紅細(xì)胞為凹圓盤形，無核。 二、測微尺的使用 (一)原理 測微尺分目鏡測微尺和鏡臺測微尺，兩尺配合使用。鏡臺測微尺是在一個載片中央封固的尺，長1毫米(1000μm)，被分為100格，每格長度是10微米。 三、計(jì)算蟾蜍紅細(xì)胞的核質(zhì)比例。 三、試劑 l／300詹納斯綠B染液、Ringer氏液(哺乳類用)。詹納斯綠 B是線垃體的專一性活體染色劑。 染色后，將組織塊移到載片上，用鑷子將組織塊拉碎，就會有一些細(xì)胞或細(xì)胞群從組織塊脫離。 三．線粒體的電鏡照片觀察 不同細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和數(shù)目不同。一般與線粒體長軸垂直排列，但也可見到與線粒體長軸平行排列的脊。第二張是恒河猴脊髓突觸內(nèi)線粒體。 (時(shí)偉紅編)實(shí)驗(yàn)三 液泡系(Vacuolar system)的活體染色及電鏡照片觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆找环N活體染色方法，了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下液泡系的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞液泡系活體染色及觀察 (一)原理在動物細(xì)胞內(nèi)，凡是由膜所包圍的小泡和液泡除線粒體外都屬于液泡系，包括高爾基器、溶酶體、微體、消化泡、自噬小體、殘?bào)w、胞飲液泡和吞噬泡，都是由一層單位膜包圍而成。 (三)結(jié)果 顯微鏡下觀察，可見軟骨細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞核周圍有許多染成玫瑰紅色．大小不一的小泡，即軟骨細(xì)胞液泡系。(時(shí)偉紅編)實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞中的微絲染色及微絲與細(xì)胞形態(tài)的實(shí)驗(yàn)觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 掌握微絲的染色方法，了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下微絲的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、成纖維細(xì)胞微絲的染色及其對細(xì)胞松馳素B的反應(yīng)(一)原理微絲普遍存在于多種細(xì)胞，對細(xì)胞的形狀和運(yùn)動有一定作用。3. 將用細(xì)胞松弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養(yǎng)液洗五次（在平皿內(nèi)換五次培養(yǎng)液，每次都要搖動），繼續(xù)培養(yǎng)、觀察。②將蓋片移入2％Triton X一100液，置37℃恒溫箱內(nèi)處理20～30分鐘，以提取骨架以外的蛋白質(zhì)，使骨架圖像清晰。 ⑤％考馬斯亮蘭染液中，染色15分鐘。 二、麗藻細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)環(huán)流及其對細(xì)胞松弛素B的反應(yīng) (一)原理 麗藻細(xì)胞大，整個細(xì)胞的中央為大液泡占據(jù)。成束的微絲出現(xiàn)在外質(zhì)與內(nèi)質(zhì)接口(溶膠和凝膠接口)并交織一起，與環(huán)流方向平行。 3．再取一塊麗藻葉片，滴一滴細(xì)胞松弛素B，10~15分鐘后蓋上蓋片，觀察。【作 業(yè)】繪出三種不同情況下細(xì)胞中微絲的分布。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，細(xì)胞中央不著色的圓形區(qū)為細(xì)胞核。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，可見脊髓前角神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中許多藍(lán)色顆粒或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即為尼氏小體。染色體中心體圖5—3馬蛔蟲受精卵細(xì)胞、分裂中期(示中心體) 二、六種細(xì)胞器的電鏡照片 （一）高爾基復(fù)合體(Golgi Complex)人體胃粘膜細(xì)胞高爾基復(fù)合體電鏡照片：細(xì)胞質(zhì)中有散在的高爾基復(fù)合體，其結(jié)構(gòu)要由三部分組成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它們共同構(gòu)成緊密重疊的囊泡結(jié)構(gòu)。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜外表面附著許多小顆粒，即核糖體。 (四)溶酶體(Lysosome) 小鼠肝細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞溶酶體電鏡照片：溶酶體為一層單位膜包圍的囊狀結(jié)構(gòu)。內(nèi)外核膜相距一定的距離結(jié)合形成核孔。 三、觀察恒河猴脊髓前角運(yùn)動細(xì)胞的電鏡照片，總結(jié)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 照片中是一個多角形的脊髓前角運(yùn)動細(xì)胞，細(xì)胞表面以非常細(xì)的線條與周圍分界，就是細(xì)胞膜。其中有許多膜性結(jié)構(gòu)形成扁平囊狀或管泡狀，密集成排的膜上附有顆粒，這就是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。(時(shí)偉紅編)實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞生理活動的實(shí)驗(yàn)觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 通過制片與觀察加深理解細(xì)胞的運(yùn)動、吞噬等生理活動。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)胞的吞噬活動 (一)原理 白細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)中能游走的單位。單核細(xì)胞由血液進(jìn)入組織后逐漸演變成巨噬細(xì)胞。 2．實(shí)驗(yàn)時(shí)，每組取一只經(jīng)上述處理的小鼠，腹腔注射1％雞血懸液0．5～1ml，注射后輕揉小鼠腹部以使紅細(xì)胞懸液分散均勻。 二、暗視野觀察細(xì)胞的纖毛和鞭毛運(yùn)動 (一)原理 暗視野照明法是一種不使照射被檢物體的光線直接進(jìn)入物鏡的照明方法。 步驟：1．將顯微鏡聚光器調(diào)到最高位，用低倍鏡調(diào)焦至清楚。5．將中央遮光板放置在顯微鏡的濾光框上，即可進(jìn)行標(biāo)本的暗視野觀察。 3．沿蟾蜍二側(cè)口角向后剪開約l厘米，將下頜翻轉(zhuǎn)固定在腹部。圖6—2 蟾蜍口腔內(nèi)面圖 結(jié)果： 1．在低倍鏡下觀察上頜粘膜細(xì)胞纖毛運(yùn)動的現(xiàn)象。 3．移取洗凈的精巢于另一干凈的平皿上，用眼科剪將精巢充分剪碎后，加入數(shù)滴自來水混勻。 三、草履蟲纖毛運(yùn)動及食物泡的形成圖6—3 草履蟲 草履蟲是一種單細(xì)胞動物。纖毛有規(guī)律的擺動使食物在胞咽聚結(jié)形成食物泡(吞噬泡)，最后脫離胞咽入胞質(zhì)。 實(shí)驗(yàn)步驟： 1．取一滴草履蟲培養(yǎng)液于載玻片上，放上幾根棉花纖維，以減慢草履蟲的運(yùn)動。 2)幾分鐘后可見草履蟲體內(nèi)出現(xiàn)許多紅色食物泡，隨著食物泡不停的在胞質(zhì)中環(huán)流，食物不斷消化，泡內(nèi)酸性減弱或近中性，顏色漸漸呈黃色，食物泡漸小，最后食物泡顏色呈藍(lán)色，不能被消化的殘?jiān)h(huán)流到身體后部的胞肛排出，不排出時(shí)不易見到胞肛。 二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡、解剖器材、蠟盤、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、水浴箱。由此對細(xì)胞中的DNA和RNA進(jìn)行定位、定性、和定量分析。 4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中30分鐘染色。 7．放入純二甲苯中透明5分鐘。如在生理?xiàng)l件下，整個蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。2. 將涂片作好標(biāo)記放在70％乙醇中固定5分鐘，室溫晾干。6. ％堿性固綠(～)中染色10～15分鐘,％酸性固綠(～)染色5～10分鐘。 三、細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶的顯示（一）原理過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變?yōu)樽厣a(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來判定過氧化物酶的有無或多少。4．取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng)6分鐘。（三）結(jié)果涂片中可見一些細(xì)胞中存在著藍(lán)色或棕色顆粒，為過氧化物酶所在位置。石蠟包埋，切片。6．浸入Schiff氏酒精液反應(yīng)15分鐘。 10．浸入Ehrlich蘇木精復(fù)染20~30秒，使細(xì)胞核著色。 五、蘇丹Ⅲ染色——顯示細(xì)胞內(nèi)脂肪(示教片)【作 業(yè)】1． 用彩色筆繪出Brachet反應(yīng)及PAS反應(yīng)的鏡下所見。 三、試劑 ／／L氯化鈣溶液、1％甲苯胺蘭染液、％詹納斯綠B染液、％NaCl溶液。 分級分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降。 二、細(xì)胞核的分離提取 (一)操作步驟 1．用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。 5．／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物， 0．25mol／／L氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。 2．比較一下分離細(xì)胞核時(shí)涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中純度如何？2． 描述一下涂片⑤所見結(jié)果。 三、試劑 Carnoy固定液、70％乙醇、醋酸洋紅染液、45％醋酸、二甲苯。 蛙紅細(xì)胞體積較大、數(shù)多，而且有核，是觀察無絲分裂的較好材料。 馬蛔蟲受精卵細(xì)胞中只有6條染色體，而洋蔥體細(xì)胞的染色體為16條，因?yàn)樗鼈兌季哂腥旧w數(shù)目少的特點(diǎn)，所以便于觀察和分析。尋找和觀察處于分裂間期和有絲分裂不同時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)變化，并轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察。 中期(Metaphase)染色體聚集排列在細(xì)胞的中央形成赤道板，由于細(xì)胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀的兩種不同現(xiàn)象，側(cè)面觀染色體排列在細(xì)胞中央，兩極各有一個中心體，中心體之間的紡錘絲與染色體著絲點(diǎn)相連；極面觀由于染色體平排于赤道面上，六條染色體清晰可數(shù)，此時(shí)的染色體已縱裂為二，但尚未分離。換高倍鏡仔細(xì)觀察不同分裂時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)特征．與動物細(xì)胞有絲分裂特征比較，找出植物細(xì)胞有絲分裂的特點(diǎn)和兩者的區(qū)別。 (二)蝗蟲精巢壓片標(biāo)本的制備 l．采集 采集到各期分裂相的標(biāo)本是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，解決這一關(guān)鍵要把握兩點(diǎn)(1)時(shí)間：沈陽地區(qū)采集，一般在8月15至25日為宜；(2)蟲體特征：雄蟲翹膀長到剛好蓋住腹部一半時(shí)，正好是雄蟲精子發(fā)生的峰季，采集最適。固定后移入70％乙醇中存放于4℃冰箱備用。 1．精原細(xì)胞(Spermatogonia) 位于精細(xì)管的游離端，胞體較小，由有絲分裂來增殖，其染色體較粗短、染色較濃。偶線期（zygotene stage）同源染色體開始配對，