基因工程原理(文件)

　

【正文】 DNABamHI片段重組分子 IApr轉化子 分別轉化 (ApS涂布 Tc平板 ApS （ 2）、含易于檢測是否有外源 DNA插入的標記基因 LacZα ，可利用 ?互補原理進行藍白篩選。pUC18和 pUC19載體利用菌落顏色篩選重組子分子克隆載體的選擇1.如常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。DH5αF’ 可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’ 的存在3. 載體容量 M13mp載體 4 kb 細菌質粒載體 10kb λ 載體 23kb cos質粒載體 48kb P1載體 95 kb pYAC載體 ∽1000 kb5.11,PM1以我獨沈久，愧君相見頻。11,20231他鄉生白發，舊國見青山。下午 20:43:42三月 211比不了得就不比，得不到的就不要。下午 三月 2120:43March20:43:4220:43:4211下午 8:4311,PM1成功就是日復一日那一點點小小努力的積累。11,20231意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。下午 20:43:42三月 211楚塞三湘接，荊門九派通。下午 三月 2120:43March20:43:4220:43:4211下午 8:4311,PM1越是沒有本領的就越加自命不凡。11,11,20238:43:42下午 三月 2120:43March20:43:4220:43:4211下午 8:43doloradipiscingurnaac,iaculiscursus.felispurus.eleifendFusceamet,POWERPOINTLorem20231一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。20231業余生活要有意義，不要越軌。 三月 11勝人者有力，自勝者強。 20:43:4220:43:4220:43Thursday, 20:43:4220:43:4220:433/11/2023 三月 21三月 21Thursday,20231空山新雨后，天氣晚來秋。20231少年十五二十時，步行奪得胡馬騎。 三月 三月 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March 20:43:4220:43:4220:43Thursday, 20:43:4220:43:4220:433/11/2023 三月 21三月 21Thursday,20231做前，能夠環視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。20231行動出成果，工作出財富。 三月 三月 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March 20:43:4220:43:4220:43Thursday, 20:43:4220:43:4220:433/11/2023 三月 21三月 21Thursday,不表達，選表達載體 (外源基因必須表達，表達產物必須具備活性 ) ⅱ) 免疫法：與上同，但表達產物不一定具生物活性 ⅲ) 雜交法：各種載體均可2) 目的基因的鑒定 次克隆：選用質粒載體，限制酶譜分析，基因結構分析等 定序：定序載體（ M13mp系列），其他質粒載體（如 pUC系列，pBR322， T3， T7， SP6啟動子載體）3) 基因表達與調控 外源基因可表達 — 普通載體 。 三者均有限制 修飾系統和重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發生重組2） 實驗對象（ 1）供體：遺傳背景與 DNA特點等，其中包括染色體 DNA大小，基因大小與結構，堿基組成，目的基因的產物特點以及遺傳物質的傳遞方式等。每一種限制性內切酶會產生不同的粘性末端，可選用兩種內切酶組合在質粒載體和外源 DNA上產生相同的末端，進行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。TcS為重組子AprTcr轉化子影印到 Tc平板上 重組分子 Ⅱ Tcs）BamHI片段 (Tcr)四、常用質粒載體舉例 pBR322載體 pUC載體 pBR322載體優點：分子量較小，為 4363bp，不僅利于自身 DNA的純化，可容納的外源 DNA也較大。表達外源基因以產生大量外源基因產物4)不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。信號肽鏈編碼區 轉錄起始區 +終止子轉化單元 宿主細胞轉化d.一般無檢測標記基因；特點 :vector）上述兩例中的非重組子來源有兩個：基因組或 cDNA文庫的構建 。特點 :普通型載體LacZβLacZαc.a.β鏈）互補，產生有活性的 β— 半乳糖苷酶，在含有指示劑 Xgal和誘導劑 IPTG的存在下，菌落呈現蘭色；外源基因的插入后，破壞了 lacZ為 α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼 145該蛋白質可分為兩部分： α鏈和 β鏈。和 lacZα） Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素 乙酰化，導致乙酰化的氯霉素不能結合在核糖體上。 Cmr） Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內酰胺環，使氨芐青霉素失活。AmprTetracycline Tcr） lacZα），絕大多數為后者。2）指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。 Tetr標記基因的作用至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進入宿主細胞。至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。第二階段： 增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區和新的遺傳標記基因。al)pBR313和 pBR322二、質粒 DNA的分離與純化（放在實驗中講）三、質粒載體的構建及類型（一）質粒載體的發展概況；（二）質粒載體的特點（基本條件）；（三）遺傳標記基因（四）質粒載體的類型（一）發展概況因此，作為載體的質粒應該是松弛型的。質粒 DNA不僅能在細菌中復制，并且在添加真核復制信號和啟動子后，可以構建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應用廣泛。DNA連接酶的連接反應 (兩種插入方向 ) +第三節 分子克隆的質粒載體 一、質粒的一般生物學特性；二、質粒 DNA的分離與純化；三、質粒載體的構建及類型；四、常用質粒載體舉例；一、質粒的一般生物學特性（一）、質粒 DNA 質粒 是細菌染色體外能夠自主復制的環形雙鏈的 DNA分子。DNA連接酶　　　　　　 TCGAPOHA5’3’TT或 TCGAPOHA5’3’TT退火HOAHOA5’PAGCTT平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多相同或相容粘性末端的連接只連接 ds特點： 3’3’5’引物 復性 5’3’引物延伸 (75℃) TaqDNA擴增技術又稱為 聚合酶鏈式反應 ，它包括以下三個步驟：主要用于 DNA的體外擴增，經 25次循環后才進入酶的反應穩定期，一個 DNA用途：DNA聚合酶1.無 dNTPDNA末端修飾 缺失2.5’ →3 ’ 聚合酶活性， 15001.和 3)常用大片段（二）、 用途 polIK)3’DNaseI與Pol Mg++存在時 DNaseI作用特點DNaseI制備 RNA樣品時除去 DNA分子用途2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關， Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置,特點： 具內切酶活性，作用于 ds 1.HO