基因工程原理-文庫吧

【正文】 酸純化，檢測等一、限制性內切酶（一）、限制修飾系統的種類（二）、限制性內切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點（四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶）（五）、 限制酶的用途（一）、限制修飾系統的種類1.I型 ： 由三個基因構成， hsdR； hsdM； hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因構成一個復合體，限制酶需要 ATP、Mg2+、 SAM（５ — 腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。2.II型 ： 限制與修飾基因產物獨立起作用，在 Ｅ . coli中這兩種基因位于質粒上。3.III型 ： 修飾酶與Ｉ型酶相同， hsdＭ與 hsdＳ基因產物結合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。上述三個系統中，只有 II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。（二）、限制性內切酶的定義、命名1.定義 ： 廣義指上述三個系統中的限制酶； 狹義指 II型限制酶。2.命名 ： 限制酶由三部分構成，即菌種名、菌系編號、分離順序。　例如： HindⅢ 　　前三個字母來自于菌種名稱H. influenzae， “ ｄ ” 表示菌系為ｄ型血清型； “Ⅲ” 表示分離到的第三個限制酶。EcoRI— Escherichia coliRIHindⅢ — Haemophilusinfluensae dⅢSacI(II)— Streptomycesachromagenes I(Ⅱ )（三）、限制酶的特點1.識別順序和酶切位點１）識別４ 8個相連的核苷酸MboINGATCN； AvaIIGG(A/T)CC BamHIGGATCC： PpuMIPuGG(A/T)CCPy NotIGCGGCCGC； SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG FokI5’ＧＧＡＴＧ (Ｎ )93’3’ＣＣＴＡＣ (Ｎ )135’外側，產生５ ’端突起２）富含ＧＣ３）對稱性 — 雙 對稱EcoRI5’GAATTC3’3’CTTAAG5’４）切點大多數在識別順序之內，也有例外５）限制酶切后產生兩個末端，末端結構是５ ’Ｐ和３ ’ＯＨ2.末端種類１） ３ ’端突起 ，個數為２或４個核苷酸Pst I5’CTGCAG3’5’CTGCAG3’3’GACGTC5’3’GACGTC5’２） ５ ’端突起 ，個數為２或４個核苷酸 EcoRI5’GAATTC3’5’GOHPAATTC3’3’CTTAAG5’3’CTTAAPHOG5’粘性末端能與另一個相同的粘連末端相連接，任何兩個具有相同識別位點的 DNA分子經限制酶切割后能夠重新連接成新的重組 DNA分子。在進行 DNA重組時，應用限制酶同時切割目的基因和載體 DNA，使之產生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組 DNA分子３） 平齊末端SmaI5’CCCGGG3’5’CCCGGG3’3’GGGCCC5’3’GGGCCC5’４）非互補的粘性末端ａ）切點在識別順序之外的，如： FokI FokI5’GGATG(Ｎ )93’5’GGATG(N)93’CCTAC(Ｎ )135’3’CCTAC(N)13ｂ）能識別簡并順序的，如： AvaIAvaI5’CPyCGPuG3’CCCGGG。CTCGGG。CCCGAG。CTCGAG（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 酶2.特點： 1）識別相同順序2）切割位點的異同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG（五）、 限制酶的用途1.DNA重組2.限制酶（物理）圖譜繪制3.突變分析（ RFLP分析）4.限制酶的部分酶切與完全酶切附： IIS型限制酶的特點1.具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結構。2.酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側， 120nt。3.酶切后的末端經補平后又可發生酶切反應。4.產生粘性末端可以是 15個核苷酸。5.均為單體，分子量為 47—108kD 。酶切圖譜的構建（ a）請構建該環狀DNA分子的酶切圖譜酶切圖譜的構建（ b）二、 DNA甲基化 酶（ 一）、 甲基化酶的種類與識別順序1.限制修飾系統 I、 II、 III型中的甲基化酶三個系統中的甲基化酶可使細菌 DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發生甲基化，形成 5’甲基胞嘧啶和 6’甲基腺嘌呤。在 DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于 II型，它與相應的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如： M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同M． HpaICmCGGHpaICCGG相同2.II型甲基化酶對限制酶活性的影響 １） 抑制同種限制酶的活性 GGATmCC— BamHI(G?GATCC)GAmATTC— EcoRI(G?AATTC)２） 抑制不同種限制酶的活性a.順序完全重疊 如： M.ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ TCGmA）b.順序邊界重疊 如： M.BamHI（ GGATmCC） MepI（ mCCGG）３） 抑制不同種限制酶的部分活性M． TaqI（ TCGmA） HindII（ GTPyPuAC）：GTCAAC， GTTAAC， GTCGmAC， GTTGAC3.甲基化酶的用途 １） 改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成２） 在建立基因文庫時，可先使 DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切 CH3CH3CH3RE RE RE RE RERE RERERE RERECH3 CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭 RE用于基因組文庫的建立用于 cDNA的連接RE RE RE三、核酸酶（ 一）、外切酶 III（ ExoIII）1.一般特點： 來自于 ，分子量 28,000kD2.催化反應類型1)160