細胞生物學實驗手冊-全文預覽

　　

【正文】 ，暴露出黃色圓柱狀精巢。 5．然后，用眼科剪刀剪取咽頭前部的上頜粘膜約22cm2小塊，用牙簽挑取剪下的粘膜，將縱切面貼于載片上。圖6—1中央遮光板a．光圈孔徑 b．濾光片直徑 (三)觀察蟾蜍上頜粘膜上皮細胞的纖毛運動 步驟： 1．用搗毀腦脊髓的方法處死蟾蜍。3．放一塊透明玻璃于載物臺透光孔上，用尺子測量光圈孔徑。利用此照明法，在鏡檢時不能直接看到通過標本的照明光線，只有被檢物體反射或衍射的光線進入物鏡可以提高分辨率，在暗視野中可以看到明亮的被檢物體的存在和運動，但它們的內部結構卻看不清楚。 4．用注射器抽取腹腔液，滴片，然后蓋上蓋片。吞噬細胞首先由于趨化作用而向異物游走，然后伸出偽足包圍異物，并發生內吞作用形成吞噬泡將異物吞入細胞，繼而溶酶體與吞噬泡融合消化異物。它們有許多生理功能，如游走性、變形運動、趨化性、吞噬異物等。 二、器材和儀器 光鏡、2ml注射器、載玻片、蓋玻片、解剖器材、滴管、移液管、試管、玻璃片、黑紙。在核的四周可見小泡，扁平囊等集合形成的高爾基復合體。核中央海綿狀的一團深色結構是核仁。 核中的海綿狀球形結構就是核仁，它由纖維和顆粒構成。 (五)核糖體(Ribosome)小鼠腎細胞核糖體電鏡照片：核糖體是由核糖核酸和蛋白質構成的大小亞基組成的橢圓形顆粒，附著于內質網上的稱附著核糖體，此外還有散在于細胞質中的游離核糖體，而多個核糖體由mRNA串連在一起叫多聚核糖體。小鼠睪丸間質細胞中含有豐富的分支管狀滑面內質網，合成固醇類的雄激素。凸出的一側為形成面，可見許多小囊泡，凹入的一側為成熟面，可見扁平囊末端呈球形膨大，在分泌細胞中膨大部分不斷脫離扁平囊，形成分泌泡。在某些卵細胞內，于核附近有圓形的小粒——中心粒，它與周圍致密的細胞質——中心球，組成中心體。 圖5一l神經節細胞(示高爾基復合體)(二)尼氏小體(Nissl’s Body)甲苯胺蘭染色的牛脊髓涂片，尼氏小體即光鏡下的粗面內質網。【實驗內容】 一、三種細胞器的光鏡切片（一）高爾基復合體(Golgi Complex)用鍍銀法染色的豚鼠脊神經節光鏡切片:神經細胞因合成運輸大量的蛋白質而含有發達的內質網和高爾基復合體，在低倍鏡下觀察，神經節的假單極細胞體被神經束分隔成群。 (三)結果 在麗藻內質中可以看到胞質環流，用細胞松弛素B處理后，胞質環流停止，洗去藥物，又出現胞質環流。 (二)方法 1．剪下一小塊麗藻葉片(1～2cm)，置于載片上，蓋上蓋片。內質中含有許多顆粒，可以清楚地看到胞質環流。 (三)結果 光鏡觀察，微絲聚集成的張力纖維束被染成藍色。M一緩沖液有穩定細胞骨架的作用。 4．對恢復的蓋片與第一張沒用藥的蓋片一同做染色處理。(二)細胞松馳素B處理成纖維細胞與染色觀察1．在平皿中有三張成纖維細胞貼壁生長的蓋片，在超凈工作臺內將一張蓋片移入另一皿中繼續培養，用作對照。二、器材和儀器 光學顯微鏡一臺、鑷子一把、小平皿六個、載片三個、吸水紙、37℃恒溫箱。 大白鼠脛骺骨細胞電鏡照片，細胞核與核仁很清楚，細胞質中有豐富的粗面內質網，液泡系發達，液泡由單層膜包圍，細胞周邊有液泡釋放。中性紅是液泡系特殊的活體染色劑，只將液泡系染成紅色，在細胞處于生活狀態時，細胞質及核不被染色，中性紅染色可能與液泡中的蛋白有關。二、器材和儀器 光學顯微鏡一臺、手術器材一套、解剖盤一個、載片、蓋片、吸水紙。第三張是小鼠睪丸間質細胞線粒體，線粒體的脊為分支的管，在照片上呈單層膜泡狀。脊的數量與細胞呼吸機能的強度有很大關系。線粒體的數目與細胞類型和細胞的生理狀態有關，線粒體多聚集在細胞生理功能旺盛的區域。 (三)結果 顯微鏡觀察，肝細胞質中許多線粒體被染成藍綠色，呈顆粒狀。 （二）方法 用空氣栓塞處死兔子，置于解剖盤內，迅速打開腹腔，取兔肝邊緣較薄的肝組織一小塊（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿內洗去血液(用鑷子輕壓)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿內加1／300詹納斯綠B染液，讓組織塊上表面露在染液外面，使細胞內線粒體的酶系可進行充分的氧化，這樣才有利于保持染料的氧化狀態，使線粒體著色。細胞的各項活動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的。【實驗用品】 一、材料和標本 兔子一只、線粒體的電鏡照片。2．按下式求出目鏡測微尺每格代表的長度 目鏡測微尺每格代表的長度(μm)=X10 三、測量人口腔上皮細胞 從顯微鏡載物臺上取下鏡臺測微尺，換上人口腔上皮細胞標本，測量細胞、細胞核的長短徑。圓片中央刻有一條直線，此線被分為若干格，每格代表的長度隨不同物鏡的放大倍數而異。 6．人口腔上皮細胞標本的制備與觀察 用牙簽刮取口腔上皮細胞均勻地涂在載片上(不可反復涂沫)，滴一滴甲苯胺蘭染液，染色5分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。白細胞數目少，為圓形。角緊貼在血滴的前緣，均勻用力向前推，使血液在載片上形成均勻的薄層。然后放在載片上，制片方法同脊髓壓片。 2．蟾蜍骨骼肌細胞的剝離與觀察 剪開蟾蜍腿部皮膚，剪下一小塊肌肉，放在載片上，用鑷子和解剖針剝離肌肉塊成為肌束，繼續剝離，可得到很細的肌纖維(肌細胞)。將上面的載片取下即可得到壓片。例如：哺乳類紅細胞成熟時細胞核消失。【實驗內容】 一、細胞的基本形態觀察 (一)原理 細胞的形態結構與功能相關是很多細胞的共同特點，在分化程度較高的細胞更為明顯，這種合理性是生物漫長進化過程所形成的。實驗一 動物細胞的基本形態觀察和顯微測量【實驗目的】 制備不同細胞的臨時制片，觀察、了解細胞的基本形態，學會使用測微尺，通過測量對紅細胞的進化進行分析。二、用鉛筆繪圖，線條要明確清晰，圖的深淺明暗一律以點的疏密來表示，點要圓而一致，不得涂暗影或進行其它美術加工。 5．眼科鑷子：用于提取神經、血管和筋膜等細軟組織。前者用于較大力量切開較長距離的堅韌的組織，如大動物的皮膚切口等；后者則用于小力量的短距離切開，或分離皮膚和肌肉等。 二、常用手術器械及操作方法： 1．解剖針：用于挑、刺等。具體方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中線稍外側(避開膀胱和血管)用酒精消毒后，首先將注射針頭向頭部方向刺入皮下，進針1～2mm后，再以45176。斷頭法需用特殊的斷頭器，二氧化碳吸入法則將小鼠放入盛有二氧化碳的容器內即可。 1．捉拿方法： 將小白鼠放在鼠籠蓋鐵網上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠則會盡力向前蹬。在頭與軀干之間可觸及一凹陷(即枕骨大孔所在處)，右手持解剖針直插入此凹陷約l～2mm，隨即將針尖轉向頭側插入顱腔搗毀腦組織。其細胞較哺乳類動物的細胞大得多，因此常用于觀察細胞形態的實驗。在醫學實驗中，常常根據不同的實驗目的而選用不同的動物進行實驗研究。班級值日生負責清掃室內衛生，關好水、電開關 和門、窗等，經教師允許后方可離開實驗室。 損壞器材或設備者應按有關規定進行賠償。實驗期間不得進行任何與實驗無關的活動。實驗中途因故需外出時應向任 課教師請假。 教材初稿曾于1989年《全國醫學細胞生物學實驗課培訓班》試用，參加該班的教師提出許多寶貴的經驗及修改意見，謹此致謝。選編了一些生物醫學常用的細胞生物學基本實驗，如細胞的顯微測量、細胞活力測定、細胞計數、細胞組分的分級分離、細胞組分的化學反應、細胞生理活動、細胞染色體技術、細胞培養、細胞融合、免疫熒光技術、電鏡技術等，為后續的課程及醫學研究打下一定基礎。細胞生物學實驗手冊前 言 這本實驗教材是為高等醫學院校細胞生物學教學編寫的，適用于五年制本科、七年制臨床專業和研究生班。大多數實驗采用生活細胞材料，由學生自己動手取材和實驗，使學生能對細胞獲得生動的認識。荊永顯、李虹、王序繪制插圖，畢衛真負責印刷出版事宜。 目 錄前 言 實驗室規則……………………………………………………………… (1) 常用實驗動物了解和解剖器械的使用………………………………… (2) 細胞生物學實驗繪圖方法與要求………………………………………（4）實驗 一 動物細胞的基本形態觀察和顯微測量…………………………………（5）實驗 二 線粒體的活體染色及電鏡照片觀察……………………………………（8）實驗 三 液泡系的活體染色及電鏡照片觀察……………………………………（10）實驗 四 細胞中微絲的染色及微絲與細胞形態的實驗觀察…………………… (11)實驗 五 細胞器的光鏡切片和電鏡照片觀察……………………………………（13）實驗 六 細胞生理活動的觀察……………………………………………………（16）實驗 七 細胞組分的化學反應……………………………………………………（20）實驗 八 細胞核與線粒體的分級分離……………………………………………（23）實驗 九 細胞分裂的形態觀察……………………………………………………（26）實驗 十 正常細胞與腫瘤細胞常規核型的標本制備…………………………… (31)實驗十一 細胞融合…………………………………………………………………（36）實驗十二 應用細胞融合技術制備染色體提前凝集標本…………………………（38）實驗十三 培養細胞的形態觀察和計數……………………………………………（40）實驗十四 細胞的原代和傳代培養…………………………………………………（43）實驗十五 酸性磷酸酶的顯示………………………………………………………（46）實驗十六 腫瘤細胞的軟瓊脂集落培養和測定……………………………………（48）實驗十七 電鏡生物標本的制備及鏡下觀察………………………………………（50）實驗十八 整裝培養細胞生物膜系統的光鏡和透射電鏡標本制備與觀察………（54）實驗十九 免疫熒光抗體法檢查細胞表面抗原……………………………………（56）實驗二十 姊妹染色單體互換標本制備與分析……………………………………（58）實驗二十一 銀染核仁形成區的光鏡和電鏡標本制備及觀察…………………… (60)實驗二十二 染色體掃描電鏡標本制備及觀察……………………………………（63）實驗二十三 細胞顯微攝影…………………………………………………………（65） 附錄一 離心機轉數與離心力的換算表………………………………（67） 附錄二 溶液的配制……………………………………………………（68） 主要參考資料……………………………………………………………（77）實驗室規則 一、遵守實驗紀律，按時到達實驗室，不得遲到或早退。 四、必須嚴肅認真地進行實驗。如遇儀器損壞或不靈，應及時報告任課教師，以便修理或更換，不要自行亂修。實驗結束后，各組必須認真清理各自的實驗臺面，將器材 清洗后點清數目，然后擺放整齊。常用實驗動物的了解和解剖器械的使用 一、常用實驗動物 常用的實驗動物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、貓、兔和狗等。 蟾蜍 蟾蜍是兩棲類動物，由于其取材方便，常用于各種實驗。具體方法是，左手握住蟾蜍的身體和四肢，使其腹部貼著掌心，食指壓住蟾蜍頭部前端使其盡量腹屈。 小白鼠 小白鼠是哺乳動物，是最為常用的實驗動物。常用的方法有頸椎脫位法，斷頭法和二氧化碳吸入法等。我們常用的是腹腔注射。～／10克體重。持法有執弓法與執筆法兩種。 4．眼科剪刀：用于剪斷神經、血管、筋膜等細軟組織。 常用手術器械執手術刀的姿勢執手術剪的姿勢執手術鑷的姿勢執手術刀、手術剪、手術鑷的姿勢(張之曾編)細胞生物學實驗繪圖方法與要求一、在仔細觀察的基礎上，選擇典型結構進行描繪，要求真實、準確(注意各部結構的比例關系)。四、每幅圖的大小、位置在紙面上必須安排得當并注意紙面的整潔。 三、試劑 1％甲苯胺蘭、1％甲基蘭、Ringer氏液(兩棲類用)。但也有例外。將另一載片壓在脊髓碎塊上，用力擠壓。染成蘭紫色的、大的、有多個突起的細胞是脊髓前角運動神經細胞，胞體呈三角形或星形，中央有一個圓形細胞核，內有一個核仁(參照照片)。 3．蟾蜍肝臟壓片的制備與觀察剪開蟾蜍腹腔，取一小塊(約2～3mm 3)肝放在平皿內，用Ringer氏液洗凈，用鑷子輕壓將肝中的血擠出。 4．蟾蜍血涂片的制備與觀察 取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在載片上．將另一載片的一端呈45176。顯微鏡觀察可見蟾蜍紅細胞為橢球形，有核。自細胞數目少，為圓形。目鏡測微尺是一個放在目鏡像平面上的玻璃圓片。 (二)方法 1．將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上夾好，小心轉動目鏡測微尺和移動鏡臺測微尺使兩尺平行，記錄鏡臺測微尺若干格所對應的目鏡測微尺的格數(圖1—2)。 計算細胞、細胞核體積的公式： 圓 形 V=4/3πr 3(r為半徑) 橢圓形 V=