細胞生物學研究方法-全文預覽

　　

【正文】 (B淋巴細胞 ) 骨髓瘤細胞 雜交瘤細胞 分泌抗體 長命 分泌抗體 短命 長命 不分泌抗體 （二） HAT培養基篩選 的原理 免疫脾細胞 經抗原免疫的 BALB/c小鼠的脾臟 小鼠骨髓瘤細胞 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶（ TK） － 缺陷型 親本細胞 主途徑：是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA， 葉酸 作為重要的輔酶參與這一合成過程。 ２ .化學介導的細胞融合（如 PEG） 細胞融合不僅可用于基礎研究 ， 而且還有重要的應用價值 ， 如動植物育種和制取單克隆抗體 等 。 兩個細胞正在融合 細胞膜的流動性是動物細胞融合的生物學基礎。 細 胞 工 程 (cell engineering) ? 概念 ： 是指應用現代細胞生物學、發育生物學、遺傳學和分子生物學的理論與方法，按照人們的需要和設計，在細胞水平上的遺傳操作，重組細胞的結構和內含物，以改變生物的結構和功能，即通過細胞融合、核質移植、染色體或基因移植以及組織和細胞培養等方法，快速繁殖和培養出人們所需要的新物種的生物工程技術。 細胞系 （ cell line） : 當培養細胞分裂增殖相互間密切接觸時，細胞停止活動的現象為接觸抑制。 細胞株 (Cell Strain) ： 細胞系（ Cell Line）：原代培養物經首次傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養物中的細胞世系（ Lineage of Cells）所組成。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。 原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統計結果，并可根據這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達 99%。 根據細胞成分所具有的這種特性 ， 可利用細胞分光光度計對一定的成分進行定位 、 定性測定 。 這種 利用放射性物質使照相乳膠膜產生該物質自身影像的技術 ， 稱為放射自顯影術 。 原位雜交技術首先是在光鏡水平上發展起來的， 放射性同位素 標記的探針與樣品中的 DNA或 RNA雜交后，用顯微放射自顯影的方法顯示雜交物的存在部位；或用 熒光素 標記的探針進行雜交，在熒光顯微鏡下直接顯示與探針雜交的核酸存在部位。 此外 ， 在免疫電鏡技術中 ， 還必須注意盡量保存樣品的精細結構 。 也可以先用一種抗體 （ 第一抗體 ） 結合到抗原部位然后用可以識別第一抗體 。 主要步驟： 炭疽桿菌 24h培養物直接熒光抗體檢測 間接熒光抗體檢測細胞培養中的豬瘟病毒 免疫膠體金標記抗體 膠體金是利用還原劑將氯化金分子聚合成具有特定大小的顆粒結構 ，1970年引入免疫電鏡技術 。 實質 就是用結合有 熒光素 的抗體與組織內抗原反應，在熒光顯微鏡下觀察抗原的存在部位。 三、特異蛋白抗原的定位與定性 免疫細胞化學技術（ Immunocytochemistry） 利用抗原和抗體的結合具有高敏感性和特異性的特點，用已知的經過標記的抗體檢測組織與細胞中相應抗原的方法。多用蘇丹染料、油紅 O、尼羅藍等溶于脂類的染料染色，使脂質呈色。 Feulgen反應 糖類顯示方法 －－－ 過碘酸雪夫反應（ periodic acid Schiff reaction,PAS反應） 基本原理 ： 過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變為乙二醛基，后者繼而與Schiff試劑（無色亞硫酸品紅復合物）結合，形成紫紅色反應產物。 ? 利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括糖類、脂類、核酸、酶等。適用于大小、形態相似而密度不同的組分。 一般步驟 ： 勻漿化 離心處理 收集分析 （一）差速離心 Differential centrifugation ? 主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器 。 這些特點適用于研究觀察生物大分子 (如 DNA、 RNA和蛋白質等 )的原子布陣和一些生物結構 (如生物膜 、 細胞壁等 )的原子排列 ,而不需要特別的制樣技術 ，并且探測過程對樣品無損傷 —— 納米科學水平 。如果探針與物體的距離發生變化，這股電流也會相應的改變。 （二）掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡原理 工作原理： 是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 ④ 復膜顯示出了標本蝕刻面的形態 ， 撈于載網上干燥后可置于透射電鏡下觀察 。 冰凍蝕刻技術的操作步驟 : ② 然后用冷刀驟然將標本沖斷開 ， 升溫后冰在真空條件下迅即升華 ， 細胞內外凡含水多的地方因失水而下陷 ,暴露出了斷裂面的 膜和其它一些結構 ,增強了斷面的浮雕效果－蝕刻 。 電子密度高、電子密度低 ：被重金屬浸染呈黑色的結構，稱電子密度高；反之，淺染的部分稱電子密度 用 重金屬鹽 （如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品 進行 染色 ；吸去染料，樣品干燥后，樣品 凹陷處 和 樣品周圍 鋪 了一薄層重金屬鹽，而 凸出處 則沒有染料沉積，從而出現負染 效果，分辨力可達 。 常用的染色劑：醋酸鈾、枸櫞酸鉛。 脫水 :等級梯度脫水，用脫水有利包埋。 實際情況下 ， 電鏡的實際分辨率常常受到生物制樣技術本身的限制 ， 如在超薄切片樣品中其分辨率約為超薄切片厚度的 1/10， 即通常切片厚度若是 50nm， 其實際分辨率約為 5nm， 遠低于電鏡的分辨本領 。將微分干涉顯微鏡接上錄像機，可以觀察活細胞中的顆粒及細胞器的運動。 。 綠色熒光蛋白改造的蜜蜂 相差顯微鏡 （ phasecontrast microscope） 是一種將光線通過透明標本細節時所產生的光程差 （ 即相位差 ） 轉化為光強差的特種顯微鏡 。 / Alexey Khodjakov, 紐約健康部門 Wadsworth 中心。 即：物質吸收短波光，發射出的長波光。 正置顯微鏡 倒置顯微鏡 （二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope 概念： 是以紫外線為光源激發 生物樣品中的熒光物質 ， 產生 能觀察到的各種顏色熒光的一 種光學顯微鏡 。 這種染色方法的基礎是組織結構對不同染料的結合程度不同。 顯微鏡適合的放大倍數 放大倍數 ：是眼睛看到像的大小與對應標本長度大小的比值。 ?構成： （ 1）光學放大系統 : （ 2）照明系統： （ 3）機械和支架系統 ?原理： 經物鏡形成倒立