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【正文】 2819眼病 骨質疏松 采用的基因正在從抗除草劑、抗菌素、抗病蟲害基因到抗逆境、高品質方向發展。核酸末端修飾酶 — 用 于 DNA和 RNA的末端修飾 restriction定義 ： 廣義指上述三個系統中的限制酶； EcoRI— Escherichia coliinfluensae d識別順序和酶切位點IAA末端種類5’GAATTC3’CTCGAG特點： 1）識別相同順序Asp718CCGC3.限制酶的部分酶切與完全酶切附： IIS型限制酶的特點20nt。產生粘性末端可以是 15個核苷酸。EcoRI不同M． HpaICa.１） 在建立基因文庫時，可先使 DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切 CH3CH3CH3RE RE RE RE RERE RERERE RERECH3 CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭 RE用于基因組文庫的建立用于 cDNA的連接RE RE RE三、核酸酶（ 一）、外切酶 III（ ExoIII）2)內切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將 DNA鍵切開， pHDNA序列測定時作順序缺失使用注意事項1)切口 ,HO 339。 OH339。P539。2b42b42b4cExoIII [α 32P] [α 32P] dCTP dCTP 539。ExoIII用于DNA標記（二）、 Rnase（三）、 RNaseH（二）、 RNase分離自牛胰臟，對熱穩定，抗去污劑（ 100℃加熱 15min仍具活性） ,（三）、 RNase（四）、 Mg3)P 5’I的 DNA聚合酶系統Pol同上 2.1） 2） 3） 4） 特點：nt/min,外切酶活性 分子因而可被擴增 4106倍。DNA模板變性 (95℃) →變性 3’5’DNA分子，要求 3’羥基和 5’磷酸基 3’TTCGAPT3’TTCGAA或 　　 5’AAGCTT3’TTCGAA編碼抗菌素抗性基因的質粒叫 R質粒 。 質粒的不親和性 ，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩定地共存的現象。第一階段（ 1977年前）： 天然質粒和重組質粒的利用，如 pSC101, 標記基因的種類 1） 抗性標記基因 （可直接用于選擇轉化子） 主要是 抗生素抗性基因 : Ampr ， Tetr ， Cmlr， Kanr， Strr 2） 生化標記基因其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如 lacZ常用的遺傳標記基因及其作用機制3)4)AAs)。lacZα和 β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大轉錄 翻譯 BamHI片段重組 DNA分子 轉化 外源 DNA BamHI片段 涂布在含 XGal和 Ap的平板上 ,白色菌落為重組子， 蘭色菌落 為原載體利用 LacZ基因篩選重組子（四）、質粒載體的類型根據載體的分子生物學特性劃分 （ 1） .至少有一個以上的克隆位點和兩個標記基因，其中一 例子 :a.a.重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。b.Ⅱ 型 :+換言之 ,被表達的外源基因一旦確定 ,用途 :pBR322PstI(Apr)片段 PstI片段 涂布 Ap平板 即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程篩選重組子的示意圖 pUC18和 pUC19 pUC系列質粒載體具有三個顯著特點： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數（不用氯霉素擴增，每個細胞含 500700個拷貝）。（ 2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質的傳遞方式 (包括人為的方法 )， DNA限制修飾系統， DNA重組基因特點，基因產物修飾系統，即轉錄與翻譯后修飾系統。 不表達 — 表達型（分泌）載體 4.8:43:4211,218:43 8:43:428:43:4211,218:43 8:43:428:43:42 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March218:43 8:43:42consecteturnullautNullaidipsum 2023/3/11三月 MarchMarch 2023/3/1120238:43:42MarchMarch 2023/3/1120238:43:42MarchMarchDH5α 和 DH5αF’ 都具有一個可供遺傳標記 lacZα 檢測的遺傳背景3） 其 MCS區與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉移到 M13mp載體，進行 DNA測序和體外突變等研究。Tcr為原載體 影印到 Ap平板上 具有兩種抗菌素抗性基因可供轉化子的選擇記號。+翻譯起始區（核糖體結合序列和起始密碼子） +3)2)c.次克隆 (subcloning)或限制酶譜分析；外源 DNA擴增。酶催化 XGal水解為蘭色產物，檢測直觀α肽基因的結構，細菌內不能產生 β— 半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。前者負責四聚體裝配，后者具 β— 半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現出酶活性，該作用稱之為 α互補作用 。Kanamycin， Neomycin和 G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。 Apr）可結合在核糖體 30s亞基中的一種蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。1)**有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。 Kanr），也可以是非選擇性的（如 lacZ）具有較小的分子量和較高的拷貝數。如 pUC系列載體。(1977,環形雙鏈的質粒 DNA分子具有三種不同的構型：共價閉合環狀DNA（ cccDNA），開環 DNA（ ocDNA），線性 DNA（ cDNA），具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開 。T 5’AAGCTT3’DNA平端來源：限制酶作用結果 。3’5’3’Pol特點：制備高比活性探針 (1010用途：3’→5’ 外切酶活性，可作用于 ssDNA和 dsDNA,3） 2） 參與 DNA復制 ,pol參與 DNA修復 ,HO1)Mn2+可使酶活達最大值DNA，但無核苷酸序列特異型，產生 5’P低聚核苷酸 。RNase339。bab4b24b24OH339。P539。HO339。P539。正式使用前，測定在一定條件下酶的反應速度3)用途 3)1)催化反應類型1.如： M.１） mCGGmATTCC限制修飾系統 I、 II、 III型中的甲基化酶均為單體，分子量為 47—108酶切后的末端經補平后又可發生酶切反應。GTACC SstI酶TCGGG。CCC5’ACGTC5’3’G5’CTGCAG3’５）限制酶切后產生兩個末端，末端結構是５ ’Ｐ和３ ’ＯＨC3’ FokNGCGGCCGC； SfiIGG(A/T)CCMboIachromagenes I（二）、限制性內切酶的定義、命名2.specificity技術平臺 ：色譜及色譜 質譜，色譜 波譜，波譜 波譜聯用等分析技術與層析、臨界萃取等分離技術技術平臺 ：大規模基因表達分析（基因芯片、 SAGE、蛋白質組等技術）以及相關信息數據庫的建立腫瘤疾病 糖尿病及并發癥 1119自主免疫系統疾病 39生物反應器 ：利用動植物