基因工程原理-wenkub

　

【正文】 生成素 如美國 Amgen公司，首次開發上市的 EPO、 GSCF到 1997年的銷售額分別接近和達到 20億美元基因工程試劑的高回報堿性成纖維細胞生長因子 新型食品；營養食品；保健食品；輕工用酶 生物反應器 ：利用動植物細胞或組織作為生物反應器，直接生產有用蛋白質輕工與食品轉基因植物 ：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、 生物制藥；基因治療；人工器官農業和畜牧業傳統的發酵工程主要用于微生物。發酵工程屬于生物技術的下游技術，是工業化大規模培養細胞、生產生物制品的一種技術。隨著科學的發展，尤其是基因工程技術的日趨完善，為酶工程賦予了新的內容，特別是利用 DNA操作技術，修飾改造酶分子的結構或活性位點、酶與底物作用位點，重組酶的生產，模擬酶的人工設計與合成等成為新的內容。將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，產生出人類所需要的物質。在體外，將帶有目的基因的外源 DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組 DNA分子。DNAcloning)。engineering)。目的基因的表達第一節 基因工程的概念及其主要內容一、基因工程的概念：基因克隆的質粒載體第四節 第六章 基因工程原理第一節 目的基因的分離第五節 基因克隆 (gene基因操作 (genetechnique)克隆 (clone):將重組 DNA分子轉移到適當的受體細胞 (亦稱寄主細胞 )，并與之一起增殖。三、基因工程技術及其應用轉基因植物轉基因動物作為生物發生器基因本身也是一個產業Rockfeller蛋白質氨基酸序列的分析蛋白質組分析酶工程的概念是酶學與工程學的相互滲透和結合所發展起來以酶為研究對象，改造并應用酶的特異催化功能。 酶工程的主要內容酶的分離純化酶與細胞的固定化技術及反應器酶制劑的發酵生產酶分子化學修飾、遺傳突變及結構改造酶抑制劑與激活劑開發與研究人工設計與合成模擬酶及酶分子發酵工程概念現代生物技術還包括動物、植物細胞和工程菌的發酵培養。發酵工程技術發酵對象：高品質新品種 轉基因動物 ：生產有用蛋白質和高品質的畜產品 /mg美國生物技術產業發展情況 美國生物制藥產品種類及數量（ PHRAM）疾病種類 疾病種類 產品數量感染性疾病 心臟病 26神經系統疾病 呼吸系統疾病 22艾滋病及相關疾病 19皮膚病 移植 13消化系統疾病 11血液疾病 7不育癥 3生長發育不良癥 2妊娠預防 175由單個質量性狀基因向多基因數量性狀轉變。中藥藥靶 （基因）或作用位點基因的尋找中藥臨床藥效 的科學評價與分析方法生物技術的應用中藥新劑型第二節 基因工程中的工具酶限制性內切酶 — 主 要用于 DNA分子的特異切割 核酸酶 — 用 于 DNA和 RNA的非特異性切割 其它酶類 用于生物細胞的破壁，轉化，核酸純化，檢測等一、限制性內切酶（一）、限制修飾系統的種類（二）、限制性內切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點（四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶）（五）、 formodificationII型 ： 限制與修飾基因產物獨立起作用，在 Ｅ . coli中這兩種基因位于質粒上。狹義指 II型限制酶。2.RIⅢSacI(Ⅱ )（三）、限制酶的特點GGATCC： PpuMIGGCCNCCGGN’N’N’N’N’CCGGI外側，產生５ ’端突起３）對稱性 — 雙 對稱A3’CA４）切點大多數在識別順序之內，也有例外EcoRI5’GOHPAATTC3’３） 5’CCC3’GGGCCC5’5’GGATG(Ｎ )93’5’GGATG(N)93’CCTAC(N)13CCCGGG。GGTACSacIGG2.突變分析（ RFLP分析）kD 。三個系統中的甲基化酶可使細菌 DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發生甲基化，形成 5’甲基胞嘧啶和 6’甲基腺嘌呤。GHpaICGG抑制同種限制酶的活性 順序完全重疊 ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ TCGmA）如： M.改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成一般特點： 3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端，有利于 DNA聚合酶反應， pH3.1)反應產物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的dsDNA，過度反應將導致 DNA降解2)基因突變 缺失缺口 ,切口 (nick)P539。P539。P 539。HO339。HO339。OH339。 P539。P539。P539。24bPP539。HOOH339。A用于除去 DNA樣品中的 RNA分子2.HDNase2+當酶濃度很低時， ds切口移位，制備 DNA探針基因突變時產生切口 3’5’的切口移位 Pol1.I具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性IIpol具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性聚合酶活性， 5’ →3 ’ ,外切酶活性 除去 3’端突起的單鏈 DNA（在無 dNTP時）補齊 5’突起端合成第二條 cDNA切口移位制備探針 T4為 pol其切除速度分別為 40和 cpm/μgDNA)。分離自水生棲熱菌，分子量為 94,000，最適反應溫度 75℃ ， 與 DNA引物退火 (45℃ )和 PCR 3’5’5’3’3’3’延伸 3’5’ 五、連接酶（一）、 T41.2.2)PAGCTT3’5’AHOPAGCTT3’TCGAPOHA5’AHOPAGCTT3’TCGAPOHA5’AAGCTTTTCGAA5’AAGCTT3’TTCGAA5’ R質粒可將其抗性轉移到缺乏該質粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。（二）、質粒的拷貝數與不親和性 質粒的拷貝數 是指某種質粒在一個細菌細胞內的數目。在細胞的增殖構成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。colE1,Bolivar2. ： 進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。至少應有一個克隆位點，以供外源 DNA插入。?注：前三個特點必不可少 。*當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的 — 檢測性標記基因。四環素抗性基因 （ 四環素抗性基因編碼一種 3992)氯霉素抗性基因 （ Chlorophenicol可結合在核糖體 50卡那霉素 (Kanr),Kanr等 抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進入細胞內。β— 半乳糖苷酶基因有 1021這兩個部分可獨立存在， 這兩個基因（ LacZ和 LacZα）均可作為標記基因。β— 半乳糖苷酶基因的優點 :b.PαβLacZ基因的結構與產物pUC18 質粒型載體 — 環狀 dsDNA分子，自主復制 （ 2） .個用于轉化體選擇，另一個用于重組子檢測。2)pBR322和 pUC載體。基因的啟動子序列和終止子序列；結構 :表達單元 外源基因表達類型 :終止子翻譯起始區 終止子（常稱之為表達分泌型載體）三種表達型載體結構圖表達載體的類型也就確定了。b.具有較高的拷貝數，經過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積 10003000個拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。重組分子 I 重組分子 Ⅱ (Aps外源