降解酒糟生物質的纖維素分解細菌的篩選及產酶研究_大學本科畢業論文(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 、酒曲、酒醅、廢舊稻草、土壤樣品的采集制備保存 樣品 30℃下細菌分離培養 50℃下細菌分離培養 相關準備工作 30℃、 50℃下預備試驗 從樣品中分離、純化細菌 通過透明圈大小、濾紙潰爛度 初篩出具有分解纖維素的細菌菌株 對篩選出的菌株進行生長曲線測定 進行濾紙、羧甲基纖維素鈉酶活測定 鑒定命名保存篩選出的目標菌落 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 5 頁 培養基 1．牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基 [14]：牛肉膏 g、蛋白胨 g、瓊脂 ~ g、 NaCl g、蒸餾水 mL，調 pH 。 2．羧甲基纖維素鈉鑒定培養基（ CMCNa） [14]：羧甲基纖維素鈉 g、蛋白胨 g 、 K2HPO43H2O g、 MgSO47H2O g、 NaNO3 g、 KCl g、瓊脂 g、蒸餾水 ，調 pH 。 3． LB 培養基 [14]： 蛋白胨 g、 NaCl g、酵母膏 g、蒸餾水 ml、調 pH 。 4．斜面保存培養基：牛肉膏 g、蛋白胨 g、 NaCl g、蒸餾水 mL，調 pH 。 5． 濾紙 崩解 培養基：蛋白胨 g、酵母膏 g、 NaCl g、蒸餾水 mL、調 pH ，每 mL 培養基加入 mL 試管中，再加入濾紙（ 1cm6cm）。 6．纖維素分解細菌活化培養液：羧甲基纖維素鈉 g、蛋白胨 g、酵母膏 g、 K2HPO43H2O g、 MgSO47H2O g、 NaCl g、蒸餾水 mL、調 pH 。 7．纖維素分解細菌產酶發酵培養液：羧甲基纖維素鈉 、 MgSO47H2O g、 CaCl2 g、 K2HPO43H2O g、 KH2PO4 g、 NH4NO3 g、 FeCl3 6H2O g、蒸餾水 mL、調 pH 。 以上培養基于 121176。C 下，滅菌 30 min 后使用。 主要試劑和儀器 試劑 1． DNS 試劑 甲液：溶解 6. 9 g結晶酚于 15. 2 mL、 10 % NaOH 溶液中， 并用水稀釋至 69 mL， 在此溶液中加 6. 9 g NaHSO3. 乙液： 稱取 255 g 酒石酸鉀鈉加到 mL、 1 0 % NaOH 溶液中， 再加入 mL、 1 % 3， 5二硝基水楊酸溶液 .將甲、乙二液相混合即得黃色試劑， 貯存于綜色 冰箱低溫保藏 1 周后使用。 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 6 頁 2．檸檬酸緩沖液：稱取 4. 2 g 檸檬酸溶于 200 .0 mL 蒸餾水，配成 0. 1 mol / L 檸檬酸溶液，稱取 5. 88 g 檸檬酸三鈉溶于 mL蒸餾水，配成 0. 1 mol/ L檸檬酸三鈉溶液。量取 0. 1 mol / L 檸檬溶液 89. 5 mL， 0. 1 mol/ L檸檬酸三鈉溶液110. 5 mL，混勻，即得 pH 4. 8 0. 1 mo l/ L的檸檬酸緩沖液。量取 0. 1 mo l/ L檸檬酸溶液 57 mL， 0. 1 mol / L 檸檬酸三鈉溶液 mL，再量取 mL蒸餾水 混勻，配成 pH4. 0. 05 mol / L 的檸檬酸緩沖液。 3．醋酸緩沖液 (pH )：取 g 冰醋酸鈉溶于 mL 蒸餾水中，用冰醋酸將該溶液的 pH 值調至 （ 約用 l2 mL） ，用蒸餾水定容至 mL。 4． CMCNa 溶液：稱取 g CMCNa（羧甲基纖維素鈉）溶于 mL醋酸緩沖液（ pH ），加熱使之溶解，保存于冰箱中，以待使用。 5．葡萄糖標準溶 液的配制：將葡萄糖放在 110 176。C 烘箱中烘 2 h 至恒重，稱取 g 烘好的葡糖糖，溶解并定容至 mL。 6．濾紙紙 1 %醋酸浸泡 24 h，用碘液檢驗確定無淀粉后。再用 2 % NaHCO3洗至中性，曬干待用。 7．革蘭氏碘液：碘 g、 碘化鉀 g、蒸餾水 mL，將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 mL。 主要儀器 儀器名稱 型號 生產廠商 冰箱 BCD215KALM 青島海爾股份有限公司 電熱恒溫培養箱 DH6000BH 天津市泰斯特儀器有限公司 電子天平 ALB224 賽多利斯科學儀器有限公司 單人單面凈化工作臺 SW— CJ— 1FD 蘇州凈化設備有限公司 恒溫振蕩器 ZD— 85A 常州澳華儀器有限公司 型電熱鼓風干燥箱 101— 2AB 天津市泰斯特儀器有限公司 型電熱恒溫鼓風干燥箱 DHG— 9240 上海一恒科技有限公司 紫外可見分光光度計 721GG 上海儀電分析儀器有限公司 高速臺式離心機 TGL— 16B 上海安亭科學儀器廠 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 7 頁 方法 分離、純化 將從貴州茅臺酒廠取樣到的樣品搗碎后，取適量濾液接 取 g樣品于 mL無菌水中制備成 1%的菌懸液，震蕩培養 30 min用無菌蒸餾水稀釋 10 1010 105四個梯度，然后再用無菌吸管吸取 100 μL菌懸液滴入牛肉膏蛋白胨培養基上涂布均勻，分別在 30 176。C 及 50176。C 恒溫培養箱中 倒置 培養 2 d，不同處理均作 3個重復。 觀察培養皿上菌落形成情況，選取優勢菌株和透明圈明顯的菌株， CMCNa培養基上用兩區劃線培養進行分離和純化 。觀察牛肉膏蛋白胨各培養基中的菌落形態特征，拍照并作好詳細記錄 。 細菌初篩 將純化的菌株接種到 纖維素鈉 (CMCNa)為唯一碳源的固體培養基的上 ， 每個培養基點 2 個樣， 不同處理均作 3 個重復。 分別于 30176。C 、 50176。C 下 倒置 培養 2 d，每天檢測觀察各菌株的菌落狀況，最后通過滴加革蘭氏碘液， 靜置 10 min，傾去染液，將平板置于白色背景下，觀察透明圈產生的清晰度， 測量菌落及淺色透明圈半徑（ R， mm），并拍照記錄 。根據透明水解圈半徑和菌落半徑的比值大小初步判斷菌株產纖維素酶的能力，選取比值大的菌株繼續進行研究。 最后保存菌落半徑與透明圈比值大于 2： 4的菌株于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基上，其活性與透明圈半徑 /菌落半徑（ R/r）在冰箱中 4176。C 條件下保存， 以作下一步的研究 [15]。 細菌生長曲線的測定 從斜面保存培養基挑取菌株單菌落，置于盛有 mL LB 液體培養基的試管中，振蕩培養 12 h，然后取 100 μL 菌懸液置入另外盛有 10 mL LB 液體培養液的試管中振蕩培養。每 4 h取樣一次通 過分光光度法測定菌體濃度 。 以未接種的LB培養液做空白對照，依次測定。 用 721G可見分光光度計，在 660 nm波長處測定 吸光度 。 然后以時間為橫坐標，以 OD值 為縱坐標，繪制菌體生長曲線。 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 8 頁 纖維素分解細菌的復篩 1．葡萄糖標準曲線的繪制 取 7支 10 mL試管，編號，按表 （ 500 mg/L）溶液與蒸餾水混勻，既得各種不同濃度的標準葡萄糖液。 另取試管 7 支，編號，用移液管準確吸取上述試管個濃度的標準葡萄糖溶液 mL，對好加入各試管，然后于各試管中加入 DNS 試劑 mL，搖勻，置于沸水中煮沸 5 min。取出后置于冷水浴中冷卻，在 721G 型分光光度計上比色。選用 520 nm 波長。 表 標準葡萄糖液的制備 管號 制備標準葡萄糖液的濃度（ μg/mL） 加 500ug/ml 標準葡萄液（ mL） 加蒸餾水量（ mL） 0 0 0 10 1 40 2 80 3 120 4 160 5 200 4 6 6 240 加入葡萄糖標準液和蒸餾水，在試管中分別加入 mL DNS 試劑，于沸水浴中加熱 5 min 進行顯色，取出后用流動水迅速冷卻，各加入蒸餾水 mL，搖勻，用 721G 可見分光光度計，在 520 nm 波長處測定 吸光度 。以 mL 蒸餾水代替葡萄糖標準液按同樣顯色操作為空白調零點。以葡萄糖質量為橫坐標， 吸光度 為縱坐標，繪制標準曲線。 根據 DNS (3， 5二硝基水楊酸 )比色法測定原理繪制葡萄糖標準曲線 [16]。 2． 粗酶液制備 將初篩選取的菌株環取一環接種到纖維素羧甲基鈉活化培養液中， 30176。C 通過靜置培養 、 50176。C 則在 120 r /min下振蕩培養 24 h，不同處理做 3個重復。 每 24 h 取一次菌液， 3500 r/min 下離心 5 min，收集上清液用于測定酶活。CMC酶活力的測定：取 CMC 緩沖液 mL于比色皿中，加入 mL 稀釋 10 倍 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 9 頁 的酶液， 50176。C 恒溫水浴中反應 30 min，加入 mL DNS 試劑，沸水浴 10 min，冷卻后定容至 mL。在 520 nm 處測 OD 值，測得 OD 值后查閱葡萄糖標準曲線，求出酶解所得葡萄糖含量，換算成酶活力值。 3．濾紙崩解 的測定 分別用接種環取一環 初篩得到的菌種，將其接種到 裝有 10 mL濾紙培養液 的10mL試管 中， 置于 30176。C 、 50176。C 恒溫搖床， 120 r /min下振蕩培養， 每天檢查記錄各菌株對濾紙的作用 情況 [17]。 觀察其酶活力的分解強度，以 +、 — 標示作用情況，本方法是以肉眼觀察為主，主觀意識為主，結果的表示只能為試驗提供參考，不能作評判的依據，但用于篩選目標菌株有很大的適用性，再配以其他方法，不是為有效的手段。具體表示： +濾紙邊緣膨脹； + + 濾紙整齊膨脹并下彎； + + + 濾紙不定形； + + + + 全成糊狀。若濾紙不到 2 4 h 全部分解，則記下達到全部被分解的時間，拍照 記錄。 4． CMC 酶活力測定 酶液的稀釋：取大號試管 13 只，用移液管吸取離心后的酶 1 mL，加水 24 mL，搖勻。還原糖的測定：取刻度試管 26 只，個加入稀釋酶液 mL， CMC 緩沖液（檸檬酸緩沖液） mL。每次測酶活時均設一個總的空白樣，即在試管中不加底物和酶液，只加蒸餾水 mL，用作測量 吸光度 時的參比。對每個樣品都設一個參照樣，先加 mL 蒸餾水，后加 mL 相應樣品的粗酶液。 在容積為 10 mL的試管管中，加入 1 mL 適當稀釋的酶液于 50176。C 和 30176。C 恒溫水浴中預熱 5 min 后， 搖勻，將試管置于水浴鍋中， 50176。C 恒溫水浴加熱，充