微生物檢驗技術考試要點(整理中級)(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 胰酶消化肉瓊脂（赫氏瓊脂）加入亞硫酸鈉或脫纖維血有刺激生長，用腐敗材料分離，培養基中加入甲紫、膽酸鈉抑制雜菌，龍膽紫亞硫酸鈉為其選擇性培養基，3%氯化鈉上生長呈多形性。小腸耶爾森：無動無芽無莢G－，25℃有動力，有周鞭毛，最適溫20～28℃，VP試驗25℃陽性，37℃陰性，KIA只利用葡萄糖，MIU22℃動力陽性37℃陰性。假結核：25℃有周鞭毛有動力37℃無動力，最適溫30℃，pH6～8。血清檢測的抗體是F1經典鼠疫“四步檢驗”：顯微鏡檢查（美蘭染色）、培養、鼠疫噬菌體裂解試驗（早期為暗黃的灰色表面粗糙的顆粒樣突起，在血培養上有花邊狀薄而透明不整齊的邊緣菌落。48小時為灰白色中央突起菌落，）、動物實驗（小鼠、豚鼠）?？焖贆z測；PCR（高度特異性基因：fra、pla、inu、hms）、免疫檢測（F1抗原）所有疑似鼠疫病人都需采取血標本，疑似腺鼠疫病人取腫大淋巴結穿剌液；肺鼠疫病人取咳痰、咽拭子標本。80. 枸櫞酸桿菌：有弗勞地，異型，無丙二酸鹽。只有弗勞地靛基質－，H2S＋，僅異型的丙二酸鹽＋，β半乳糖苷酶，賴氨酸脫羧酶，枸櫞酸利用三試驗：枸櫞酸菌＋－＋，沙門－/＋＋＋，愛德華－＋－。：免疫層析技術。其優點標記物非常穩定。，能使明膠分解為氨基酸而液化。氧化酶試驗用于腸桿菌科與假單胞菌的鑒別。膽汁溶菌試驗用于肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌鑒別ONPG試驗—遲緩分解乳糖的細菌試驗為陽性。83. 沙雷菌：最適溫10～36℃，4%氯化鈉下可長，產生靈紅霉素（非水溶）和吡羧酸（水溶），關鍵生化是DNA＋和葡萄糖酸鹽＋。85. 霍亂菌：呈弧狀或逗點狀，米泔樣糞便作懸滴觀察，細菌呈穿梭樣或流星狀運動；糞便涂片鏡檢見排列如“魚群”狀G－菌，耐堿不耐酸。血清分型可分為AB的小川型，AC的稻葉型，ABC的彥島型病原分離：水樣便直接接種在硫代硫酸鹽－檸檬酸鹽－膽鹽－蔗糖平板（TCBS）上37℃形成較大黃菌落，在含亞碲酸鉀或慶大霉素平板選擇性平板上呈灰褐色。食品及水樣常用堿性蛋白胨水增菌培養后再接種，鈉離子可剌激生長，但在＞8%NaACI中不生長。常用的保存或運送及增菌用堿性蛋白胨水，文臘二氏，卡布。病原鑒定： O1群無芽胞，無莢膜，單一鞭毛 ；O139群菌體周圍有一層比較薄的莢膜。測定耐熱的特異性O抗原，用玻片凝集或ELISA鑒定， 血清效價1：401：50。不耐熱的非特異性H抗原，有兩個環狀染色體，即染色體染色體2。深入鑒定：流行株與非流行株依靠噬菌體生物分型法。噬菌體（VP1VP5）將埃爾托型霍亂弧菌分成32個噬菌體型。根據溶原性、溶原噬菌體的敏感性、山梨醇發酵試驗、溶血試驗，將埃爾托型霍亂弧菌分成al共12個生物型。常見的流行株為噬菌體13型，生物型ad型，常見的有：la、lb、ld。產毒基因鑒定：用PCR檢測ct基因，流行株常帶有霍亂腸毒素。免疫檢測：霍亂為腸為非侵襲性細菌，主要剌激局部黏膜產生分泌性AgA抗體，同時大量毒素及細菌脂多糖體的產生使機體產生抗毒和抗菌抗體。恢復期帶菌者是指臨床癥狀消失后3個月內帶菌者，恢復期帶菌的時間一般不超過 2 周，健康帶菌者的排菌時間一般不超過7天。86. 副溶血弧菌：嗜鹽性弧菌（與霍亂顯著區別），是我國沿海地區最常見的食物中毒病原菌，兩極濃染，NaCl最適35g/L，無鹽不長，～，最適pH ，不耐熱，不耐酸，在TCBS上不發酵蔗糖菌落綠色，＞80g/L鹽內不長，神奈川現象（β溶血），KP+是致病株能使人或兔紅細胞發生溶血對馬紅細胞不溶血為陽性。87. 氣單胞菌最適生長溫度30℃，但在0～45℃皆可生長。88. 彎曲菌屬是一類微需氧菌，不分解糖，氧化酶+，菌體彎曲逞豆點狀，S狀或螺旋狀有動力G－菌，5種5亞種，對人致病的主要是空腸彎曲菌（人類腹瀉最常見之一，43℃生長，25℃不生長）89. 幽門螺桿菌（HP）：常用布氏培養基或腦心浸液血瓊脂加入5～10%羊血和馬血，在（85%N、10%CO5%O2）條件下，37℃3—7天，長成針尖狀的半透明菌落，加入萬古霉素、TMP、兩性霉素B等組成抑菌劑防止雜菌生長。與十二脂腸潰瘍、胃癌、胃淋巴瘤發病有關。傳染源主要是人，糞口途徑。標本：胃黏膜活檢組織；病原鑒定：生物特性是具有大量高活性的尿素酶，迅速分解尿素，氧化酶＋、觸酶＋，具有堿性磷酸酶、r谷氨酰轉肽酶活性，硝酸鹽還原＋，可生長于5%甘氨酸、%氯化三苯四氮唑培養基中，三糖鐵中不產生硫化氫，微需氧5～8%，37℃生長，25℃和42℃均不生長的G－菌，初次分離要3～4天。快速檢測：尿素呼吸試驗簡單快捷，可以特異地診斷HP現癥感染，敏感性高。主要采用13C、14C（放射性同位素）標記尿素，13C用于兒童和孕婦。90.《伯杰系統細菌學分類》的標準：G染特性，形態，鞭毛，芽胞，莢膜，代謝產物。91. 有芽胞的厭氧菌：只有梭菌屬包括83個種。厭氧菌每克糞中高達1012個，標本絕不能被正常菌污染，應盡量避免接觸空氣。最理想的標本是組織，送到實驗室后20～30min內處理完不超過2h。應接種固體和液體兩種培養基，應使用預還原培養基，液體培養基應煮沸10min以驅氧并立即冷卻。每份標本至少接種三個血平板，置于有氧，無氧，5%～10%CO2環境中培養。厭氧手套箱培養法是迄今最佳厭氧培養儀器之一。92. 厭氧狀態的指示劑有：美藍和刃天青，無氧時白色，有氧時美藍藍色，刃天青粉紅色。紫外線下出現熒光也是厭氧菌參考之一，卡那霉素用于梭桿菌與類桿菌的區分，甲硝唑用于厭氧菌和非厭氧菌的區別。氣液相色譜已成為鑒定厭氧菌及其分類比較可靠的方法。93. 破傷風桿菌：鼓槌狀，早期培養G＋，48h后特別是芽胞形成后G－，的O和H抗原，主要癥狀為骨骼肌痙攣，不發酵糖類，能液化明膠產H2S。產生兩種外毒素：破傷風溶血素、破傷風痙攣毒素94. 產氣莢膜梭菌：G＋，20～50℃均能生長，最適為45℃，雙層溶血，可分解糖類產酸產氣，出現洶涌發酵現象，分5型，主要是A型，外毒素以A毒素為主，本質是卵磷脂酶（α毒素），在蛋黃瓊脂平板上菌落周圍出現乳白色渾濁圈。所致疾病為氣性壞疽，有捻發感，青霉素為首選，萬古為次選。95. 肉毒梭菌：G+，芽胞膠囊于次極端呈湯匙狀或網球拍狀，嚴格厭氧，8型，以A，B多見，毒素不耐熱，1min煮沸即死。96. 無芽胞厭氧菌是一大類正常菌群，引起感染是內源性感染。97. 白喉棒狀桿菌：為放線菌，G+，無莢無芽無鞭無毛，奈瑟（Neisser）染色成黃褐色，一端或兩端染成藍色或深藍色顆粒即異染顆粒，阿培特（Albert）染色菌體呈藍綠色，異染顆粒成藍黑色。分離培養：棉拭子取咽喉部、鼻腔、皮膚病變部位，血平板，呂氏血清斜面（生長迅速，乳白色，S型，形態典型），哥倫比亞血培養基及亞碲酸鉀血瓊脂（48小時以上，菌落黑色，篩選鑒別）。白喉毒素是一種毒性強、抗原性強的蛋白質，B棒狀桿菌噬菌體毒素基因（tox+）編碼的蛋白質，PCR擴增tox+基因輔助診斷不能確診。免疫沉淀試驗（EleK平板試驗）檢測產生白喉外毒素，是診斷白喉的關鍵試驗。細菌一般不侵入血，但外毒素可入血引起毒血癥，不能立即送檢時應浸于無菌生理鹽水或15%甘油鹽水中。出現各種心肌炎，軟腭麻痹是白喉晚期死亡的主要原因。（白喉類毒素、百日咳菌苗、破傷風類毒素的混合疫苗DPT） 98. 百日咳鮑特菌：專性需氧，常用包姜培養基（含青霉素G）細小S銀灰色不透明珍珠狀菌落，在加血培養基上,周圍有狨毛狀狹窄溶血環，液體培養基中混濁生長。菌落常SR相變異，Ⅰ相S型，Ⅱ、Ⅲ相過渡型，Ⅳ相R型。有百日咳毒素，絲狀血細胞凝聚素和腺嘌呤環化毒素。細菌不進入血流。臨床分為3個期：卡他期痙咳期恢復期。依據菌落性狀及凝集試驗確診?？乖蠵T、FHA，主要用ELISA方法?？色@持久免疫力咳碟法：包姜培養基（含青霉素G）置10cm使飛沫直射于培養基上，37℃23天鼻咽拭子法：—%蛋白胨生理鹽水中2小時內檢 99. TBETris硼酸緩沖液，長時間電泳選用。MIC最小抑菌濃度101．決定細菌的形態因素：培養基的成份、PH、培養時間、溫度。直接觀察細菌的超微結構：超薄切片技術、電子顯微鏡。102. 芽胞：在80℃水中迅速死亡，在100℃水中能耐受2小時以上，在70%乙醇中能存活20年。高壓蒸氣滅菌殺死細菌牙芽胞最有效。莢膜的重要功能：抗吞噬。是構成細菌毒力的因素之一。衛生毒理學1．外源化學物在體內的生物轉運：吸收、分布、代謝、排泄四階段?；瘜W毒物在體內的代謝分為兩相：Ⅰ反應氧化、還原、水解；Ⅱ反應與體內源性物質結合亞慢性毒性試驗目的：最大無作用劑量、最大耐受劑量估測閾劑量。（選用兩種種屬及嚙齒類、非嚙齒類，初斷乳動物）慢性毒性試驗目的：最小有作用劑量、閾劑量、最大未觀察到有害作用劑量（選用兩種種屬及嚙齒類、非嚙齒類，初斷乳動物）危害性評價組成：認定、描述、接觸評定、特征分析毒理學試驗項目：第一階段：急性毒性試驗。第二階段：遺傳毒性試驗。第三階段：亞慢性毒性試驗。第四階段：慢性毒性試驗和致癌試驗GB 19489—2004《實驗室生物安全通用要求》分級：危害等級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。生物安全防護水平（BSL4）。生物安全柜一級：可保護工作人員和環境。生物安全柜二級：分AABB2可保護工作人員、環境、樣品。生物安全柜三級：2．普通光學顯微鏡：,不能觀察細菌的亞結構3．暗視野顯微鏡：,、 mm4．熒光顯微鏡：5．—,。微量吸管5—1000ul。培養皿分：10cm蛋白質、核酸提取及相關設備一、蛋白質分離純化實驗室常用鹽析法（硫酸銨）。核酸純化酚、氯仿抽提制備細胞外膜蛋白超聲波細胞粉碎機。大多數限制內切酶使用溫度37℃，保存溫度是20℃。二、層析凝膠過濾法（分子篩層析法）主要用于蛋白或核酸分離。介質：葡聚糖。過濾中先洗脫的是大分子物質，后小分子物質。原理：纖維素或凝膠介質帶電荷不同。三、檢測儀 分光光度計及檢測物質分光光度計波長nm比色皿檢測細菌濃度可見分光光度計600玻璃測定顏色可見分光光度計450檢測蛋白紫外分光光度計280石英檢測核酸紫外分光光度計260石英紫外透射儀：暗室紫外線下看DNA條帶。測序儀：蛋白測序儀測定氨基酸排列順序 DNA測序儀測核苷酸排列順序。物質是；質粒、噬菌體、PCR產物擴增儀：能做PCR稱DNA擴增數 酶標儀：二、電泳類：用于原 理聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）蛋白質、核酸分離用垂直電泳槽，凝膠介質形成立體多孔網狀結構，過硫酸銨起催化聚合作用, Tris甘氨酸緩沖液。分離DNA片段最佳范圍5500bp十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）蛋白分離聚丙烯酰胺濃度越大，線性分離范圍越小。十二烷基硫酸鈉作用是解離蛋白，常用蛋白染料考馬斯亮藍，甘氨酸—緩沖瓊脂免疫電泳蛋白分離和鑒定脈沖電場凝膠電泳（PFGE）核酸分離用瓊脂糖作介質。為正交的交變脈沖電場；條帶靠近負極為大片段DNA，靠近正極為小片段DNA。DNA染色用溴化乙錠（EB）或硝酸銀。（分析大分子物質）瓊脂糖凝膠電泳核酸分離與純化1%瓊脂糖作支持介質，有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。用水平電泳槽，充分分離DNA片段最佳范圍200bp50kb等電聚焦電泳（IFE）蛋白質分離以兩性電解質制造凝膠有不同PH，使帶不同電荷的多肽在電泳條件下于等電點停留。用聚丙烯酰胺制備等電聚焦電泳凝膠。濃縮效應、分辨率高、重復性好、用時少對流免疫電泳（CIE）測定抗體或抗原，使抗原抗體均帶負電，抗原向正泳，抗體電滲作用向負泳?；鸺娪緶y抗原量交叉定量免疫電泳醋酸纖維膜電泳免疫球蛋白鑒定變性聚丙烯酰胺凝膠單鏈（DNA或RNA）片段分離與純化四、快速斑點免疫金滲濾法（滴金免疫法）：屬于常用的膠體金技術。方法是以硝酸纖維素膜（NC膜）為載體，將試劑和標本滴加在膜上，通過滲濾而逐步反應，全程可于數分鐘內完成，陽性在膜上呈紅色斑點?；驹硎情g接法或夾心法免疫膠體金技術用于檢測：抗原、半抗原、抗體ATCC是指美國典型培養物保藏中心。MPS單核吞噬細胞系統，又稱巨噬細胞系統。玻片凝集反應23分鐘看結果；試管凝集反應18—24小時看結果；沉淀反應72小時看結果；補體結合試驗（CFT）30分鐘看結果過濾式微生物采樣器根據過濾材料不同有：薄膜過濾器、玻璃纖維過濾器、凝膠過濾器、谷氨酸堿過濾器。病毒的分子生物學鑒定：病毒核酸和蛋白質測定。蛋白質使用免疫測定技術、電泳技術、質譜技術；核酸使用—探針技術、雜交技術、聚合酶鏈反應技術構建基因組文庫，初始DNA長度須在90kb以上。純化的mRNA在70%的乙醇中可保存1年以上。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4或6個核苷酸?！?在酶切圖譜制作過程中,分離鑒定和純化DNA片段的標準方法聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、瓊脂糖凝膠電泳。普通水平電泳制備染色體DNA酶切圖譜時，DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系，分離＜ %%，分離＞10kb %%，在低電壓時，線狀DNA片段的遷移率與所加電壓成正比，電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使＞2kb DNA片段的分辯率達到最大，所加電壓不得超過5V/cm。細菌的培養技術一、培養基：營養物質：蛋白胨、肉浸汁和牛肉膏、糖醇類、血液、動物血清與雞蛋、無機鹽類、生長因子。二、水分。三、凝固物：瓊脂、明膠、卵蛋白及血清瓊脂：成份為多糖，賦形物。固培養基2—3%，—%明膠:主含蛋白質,24℃以上溶解,20℃以下凝固四、抑制劑：五、指示劑：酚紅、溴甲酚紫、中性紅、甲基紅、溴香草酚藍、中國藍、酸性復紅等酸堿指示劑；美藍氧化還原指示劑