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第三章核酸技術(編輯修改稿)

2025-11-29 14:44 本頁面

　

【文章內容簡介】肽鏈抗體復合物不溶性交聯抗原基質親和層析柱吸附洗脫免疫沉淀法優點：可分離到含量僅為 1%的 mRNA，但必須使用高純度的抗體，不能發生交叉反應和污染核酸酶 2) 多聚核糖體 RNA的分離純化多聚核糖體 +SDS 蔗糖密度梯度離心或蛋白酶 K苯酚抽提 4. RNA的分級分離 1) 分子量大小分級分離 i. 蔗糖密度梯度離心 ii. 凝膠電泳 2) 核酸序列分級分離 i. 分子雜交法：適用于同源性很高的 RNA的分離 DNA分子變性結合到 NCF RNADNA雜交洗滌洗膜乙醇沉淀 ii. 親和層析法：低聚 dT纖維素 : 用于 poly(A)較長的 mRNA；多聚 U瓊脂糖 : 用于 poly(A)較短的 mRNA（ 20A） RNA進樣吸附洗滌洗脫收集 260nm處吸收峰樣品乙醇沉淀 iii. 無 poly(A) mRNA的分離純化多聚核糖體核糖體亞基 +mRNP 離心 mRNP 蛋白酶 K mRNA 低聚（ dT）纖維素層析洗出液乙醇沉淀（無多聚 A mRNA） 5. RNA的質量評估方法 1) 光密度值測定法 A260/A280= 2) 凝膠電泳 3) 體外蛋白質翻譯細胞裂解物胍鹽法總 RNA 分子雜交法 — 特異 RNA分子熱苯酚法凝膠電泳圍 RNA 大小分級分離大小范蔗糖密度梯度離心一定 LiCl/ 核酸序列尿素法離心分級分離親和層析法 — poly（ A） RNA分子高速離心法全部多聚核糖體上清液鎂鹽沉淀法蔗糖密度梯度離心 — 結合與游離多聚核糖體分級分離法蔗糖連續密度 — 一定范圍大小核糖體多聚核糖體 RNA 免疫沉淀法 —— 特異性多聚核糖體第二節核酸電泳 1. 種類 1) 按凝膠材料分 : 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳 (普通瓊脂糖和低熔點瓊脂糖 ) 2) 按電泳裝置分 : 水平式 /瓊脂糖凝膠。豎式 /聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍。操作難易 2. 用途瓊脂糖凝膠用于 DNA和 RNA的常規分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。 3. 凝膠電泳的一般程序制膠點樣電泳染色觀察二、 DNA電泳 1. DNA分子種類 1) 線狀 DNA— 單鏈與雙鏈， ssDNA電泳時要注意局部區域形成 dsDNA，造成遷移距離不確定 2) 環狀 DNA— 單鏈（如 M13mp）和雙鏈（質粒 DNA） 3) 線狀 dsDNA電泳 — 使用頻率最高的一種電泳這類 DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個因素的影響： i. 分子量的大小 : 遷移距離與分子量的常用對數成反比 ii. 凝膠濃度 : 濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量 DNA : 低電壓時，遷移率與電壓成正比；電壓增高時，不同大小 DNA片段遷移率增大是不同的。 : 不受影響 ,溫度高可導致 DNA帶變形或解鏈。 4) 環狀 dsDNA電泳 : 常用于質粒 DNA的初步鑒定 5) 線狀 ssDNA電泳鏈分離凝膠：化學定序時，用于單鏈分離。 DNA雙鏈互補，但組成不一樣，仍可分離（機理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。核酸定序凝膠 (染料指示劑 )：為避免局部區域產生二級結構，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）三 . RNA凝膠電泳方法：不同的 RNA電泳方法是依據使 RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使 RNA分子在點樣時是一級結構，

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