分子生物學試驗的常見問題與解決方案以下所有都轉自胡老師的新浪(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 間的污染，也是一個值得注意的問題，由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取時要十分小心，吸時要慢，吸取盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染；⑤同時要注意操作時不要劇烈地搖動反應管，開蓋時也容易造成氣溶膠污染。每次實驗完畢都要及時清理實驗臺面，%次氯酸鈉消毒后再打開紫外燈照射半小時。（2）RTPCR本身使用的試劑污染在試劑配制過程中，由于加樣槍、容器及其它溶液被污染。對策：所有試劑都應盡量小量分裝，以減少重復加樣次數，避免污染機會，另外RTPCR試劑應盡可能密封好分類存放。每次操作完畢后同樣要進行臺面消毒和紫外線照射消毒。（3）擴增產物的污染，極微量的擴增產物污染就可造成假陽性。對策；每次實驗完后，擴增產物都要及時密封后處理。設陽性對照。（4）操作人員污染：只要存在少量的RNA酶就會引起RNA的降解，從而影響結果的準確性，RNA酶可存在操作人員手汗、唾液中，也可灰塵中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成實驗失敗。對策；操作人員應戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。設置PCR操作專用實驗室，所用實驗用具應為專用，并合理分隔實驗室，將樣品的提取、配制RTPCR反應液、PCR循環擴增等步驟分室進行，實驗前應將實驗室及實驗人員工作服用紫外線或臭氧消毒以破壞殘留的DNA或RNA。，對照RNA獲得擴增結果可能原因；（1）對照RNA中含有痕量DNA。對策：第一鏈cDNA稀釋1:1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。（2）有可能是引物二聚體的條帶。可能原因：由于模板量過高而導致PCR結果產生了高分子量的DNA膠狀物。對策：將第一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。bbsbio20090708 12:423 定量PCR 無CT值（信號）出現 可能原因：（1）反應循環數不夠 對策；35個循環以上，可根據實驗情況增加循環（如至45cycles），但高于45個循環會增加過多的背景信號。（2）測熒光信號的步驟有誤對策：一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。（3）引物或探針降解 對策：可通過PAGE電泳檢測其完整性。（4）引物或探針的設計，如探針高于引物的溫度不夠，造成探針未雜交上而產物已延伸的情況。對策：重新設計引物或探針（5）模板量不足對策；對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。（6）模板降解 對策：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。 CT值出現過晚可能原因：（1）擴增效率低，反應條件不夠優化對策：設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。（2）PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足（3）PCR產物太長 對策：一般采用80150bp的產物長度。 標準曲線的線性關系不佳可能原因：（1）加樣存在誤差，使得標準品不呈梯度 對策：精確操作。（2）標準品出現降解 對策：避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。（3）引物或探針不佳 對策：重新設計更好的引物和探針（4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高 對策：降低模板濃度或重新制備。 陰性對照也出現明顯的起飛 可能原因：（1）混合物或水被污染 對策：避免污染。（2）引物二聚體的出現對策：用SG法在35cycles以后陰性出現起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。（3）反應過程中探針的降解 對策：用PAGE電泳對探針進行檢測。（4）如果使用了ROX校正，則可能是ROX的降解所造成。 熔解曲線不止一個主峰可能原因：（1）引物設計不夠優化 對策：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。（2）引物濃度不佳 對策：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。（3）鎂離子濃度過高 對策：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。（4）模板有基因組的污染對策：RNA提取過程中避免 DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。 擴增效率低可能原因：（1）反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。（2）反應條件不夠優化 對策：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。（3）反應體系中有PCR反應抑制物對策：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。 實驗重復性不好 可能原因：（1）加樣不準確 對策：精確操作。（2）儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度均一性不好。（3）模板濃度低。樣品初始濃度越低，重復性越差 對策：應減少樣品的稀釋倍數。 大部分的雙鏈DNA在95176。C就開始解鏈了，在有些情況下在90至94176。C都不能很好地變性DNA。由于部分變性，參加反應的探針和引物相應的減少了，因此反應效率會下降。 變性時間是否合適15到20秒對于變性擴增子是足夠了，然而，長一點的產物，可能會需要30秒，60秒的變性時間通常是不需要的。 退火溫度和時間是否合適 檢查引物和探針的Tm值，SYBRGreenI的退火時間大約20到35秒，雙標記探針通常是兩步法，退火和延伸合并為一步，時間大約是45到60秒，溫度通常在60176。C，對于FRET探針退火步驟大約20到30秒。 SYBRGreenI應當在72176。C，此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態，如上所述，雙標記探針通常是兩步檢測，因此信號采集應該在退火延伸的整合步驟。對于FRET檢測，數據應該在退火步驟檢測。如果對于信號采集點不確定，可以多點采集作對比。如果監控屏幕檢測不到信號，檢查程序設定是否存在至少一個的信號采集點。一些情況下會看到曲線超過了窗口范圍，在熒光強度100的地方成一直線。盡管大部分的數據可以用，但是減少增益，一些原始數據就不會超出范圍。有時，在第一個循環信號就跳出了窗口范圍，這是由于增益選得太高，看起來像沒有檢測到數據。如果熔解曲線分析時，開始熒光就達到了100，則應當用低的增益重新運行，而不需要重新運行擴增反應，SYBRGreenI和FRET的樣品可以在一定程度上反復使用。4 DNA限制性內切酶酶切反應 DNA完全沒有被內切酶切割可能原因：（1）內切酶失活 對策：標準底物檢測酶活性。（2）DNA不純，含SDS、酚、EDTA等內切酶抑制因子。對策：將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA（3）條件不適（試劑、溫度）對策：檢查反應系統是否最佳。（4）DNA酶切位點上的堿基被甲基化 對策：換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶，重新將質粒DNA轉化至dcm，dam基因型的細菌菌株。（5）DNA酶切位點上沒有甲基化（如Dpn I） 對策：換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質粒轉至dcm+ dam+菌株中擴增。（6）DNA位點上存在其它修飾 對策：將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證。（7）DNA不存在該酶識別順序 對策：換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證。 DNA切割不完全可能原因：（1）內切酶活性下降 對策：用510倍過量消化。（2）內切酶稀釋不正確 對策：用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶。（3）DNA不純，反應條件不佳 對策：將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA；檢查反應系統是否最佳。（4）內切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾 對策：換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶，重新將質粒DNA轉化至dcm，dam基因型的細菌菌株；將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證。（5）部分DNA溶液粘在管壁上 對策：反應前離心數秒。（6）內切酶溶液粘度大，取樣不準 對策：將內切酶稀釋，增大取樣體積。（7）酶切后DNA粘末端退火 對策：電泳前將樣品置65℃保溫510分鐘，取出后置冰浴驟冷.（8）由于反應溶液、溫度、強烈振蕩使內切酶變性 對策：使用標準反應緩沖液及溫度，避免強烈振蕩。（9）過度稀釋使酶活性降低 對策：適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏。（10）反應條件不適 對策：使用最佳反應體系。（11）識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序 對策：加大酶量510倍。 DNA片段數目多于理論值 可能原因：（1）內切酶星狀活性對策：檢查反應條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均可導致星狀活性，降低酶的使用量。（2）其它內切酶污染 對策：用λDNA作底物檢查酶切結果。（3）底物中含其它DNA雜質對策：電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段。 酶切后沒有觀察到DNA片段的存在可能原因：（1）DNA定量錯誤（如RNA含量較高） 對策：用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量。（2）在酶切反應液中形成非特異性的沉淀 對策：在反應前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次。 內切酶保存期內快速失活可能原因：（1）保存溫度不合適 對策：內切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應在20℃低溫保存。（2）以稀釋形式保存 對策：稀釋酶液不宜長期存放，應一次使用。（3）貯藏緩沖液不適當 對策：使用廠家推薦的貯藏緩沖液。（4）低蛋白濃度 對策：內切酶與500ug/ml的BSA一起保存。 電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一可能原因：（1）DNA上結合有蛋白質對策：電泳前上樣液65℃加熱5min，%的SDS，酚/氯仿抽提純化。（2）內切酶中含有DNA外切酶 對策：減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶。 酶切后的DNA片段連接效率低可能原因：（1）含磷酸鹽的濃度高 對策：透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽（2）內切酶失活不全或含有ATP酶 對策：延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA。（3）平末端連接 對策：加大T4 DNA連接酶的用量。（4）外切酶污染 對策：減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA。（5）連接緩沖液不合適 對策：重新配制連接緩沖液。bbsbio20090715 12:415 DNA的連接反應 TA克隆連接失敗或效率低可能原因：（1）連接緩沖液活性低，ATP降解或緩沖液稀釋不當 對策：使用一次性分裝的緩沖液，避免反復凍融。提供的T4連接酶緩沖液為十倍濃度，正確稀釋。（2）連接酶失活 對策：更換連接酶（3）PCR產物中含有抑制連接的成分，導致連接失敗 對策：將PCR產物和連接反應對照混合，觀察是否存在抑制效應。如懷疑有抑制成分存在，應重新純化PCR產物。（4）PCR產物沒有3’A突出端，不能連接 對策：使用能產生3’A突出端的DNA聚合酶或平端PCR產物先通過聚合酶及dATP進行加尾反應產生3’A突出端，再與T載體連接。（5）載體T突出端丟失，引起載體平端連接對策：避免核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用無外源核酸酶的T4連接酶。（6）插入片段與載體比例不理想 對策：優化比例 粘端連接注意事