分子生物學(xué)試驗(yàn)的常見問題與解決方案以下所有都轉(zhuǎn)自胡老師的新浪-文庫吧

【正文】 數(shù)的表達(dá)載體，一類是基于質(zhì)粒Rl基礎(chǔ)上的單復(fù)制起始表達(dá)載體；另一類是雙復(fù)制起始表達(dá)載體，一個(gè)復(fù)制起始來源于Co1EI，另一個(gè)來源于質(zhì)粒pSC101；（2）將外源基因插入到大腸桿菌的染色體中chopin等報(bào)道，將分泌型IGFI的基因，采用串連式的重復(fù)方式插入到大腸桿菌染色體的attλ位點(diǎn)，在不添加抗生素誘導(dǎo)的條件下，采用高密度發(fā)酵，IGFI基因十分穩(wěn)定。 問題6：在分泌型異源蛋白的表達(dá)中，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì)，應(yīng)如何去除？ 解決方案：⑴ 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)甲硫氨酸氨肽酶基因。 ⑵ 在分離純化后在體外用外肽酶處理。但它們都對(duì)與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。 問題7：把所表達(dá)的目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。如何實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的外分泌表達(dá)？ 解決方案：（1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá)；（2）與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá)；（3）改變培養(yǎng)基的成分。但方法僅對(duì)外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。 問題8：如何使外源基因高效表達(dá)？ 解決方案：（1）表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)：構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對(duì) mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：SD序列 UAAGGAGG的?胄室? AAGGA 高36倍；翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是68個(gè)堿基長度，與 AAGAA 的最適距離是57個(gè)堿基長度；ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 34個(gè)堿基，與 AAGAA 至少相隔5 個(gè)堿基mRNA 的翻譯才能進(jìn)行；ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T 堿基豐富時(shí)，mRNA 翻譯效率較高。其次，盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)需要注意的事項(xiàng)。在必要的情況下，還可通過定點(diǎn)突變，PCR 等技術(shù)改變個(gè)別關(guān)鍵的堿基來破壞mRNA 5’端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順反子結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個(gè)SD序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因 5’端序列容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下。再者，在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，充分利用各個(gè)基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn)，注意引入翻譯增強(qiáng)子序列。（2）共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因：由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。； 基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度。（3）提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性：利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)；共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因；對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造；在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。（4）高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞：：大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種。工程化宿主細(xì)胞：，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對(duì)目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用的根本途徑。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對(duì)氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對(duì)溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值；用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷；改變代謝流的方向，通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行。：rpoH基因編碼大腸桿RNA聚合酶的r32亞基，r32 亞基對(duì)大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。rpoH 基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。bbsbio20090706 13:21問題比較長，我總結(jié)出來，大家可以很清楚的看到都有哪些問題 Southern雜交 藍(lán)白斑篩選 外源基因在大腸桿菌的表達(dá) PCR反應(yīng) DNA的連接反應(yīng)amp。細(xì)菌的培養(yǎng) southern雜交細(xì)菌的藍(lán)白斑篩選法篩選轉(zhuǎn)化子bbsbio20090707 12:591 PCR反應(yīng)，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 可能原因：（1）模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)；②模板中含有Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚，模板本身拷貝數(shù)低；⑤模板核酸變性不徹底。對(duì)策：純化模板；配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改；如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA。（2）酶失活對(duì)策：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。（3）引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策：①選定一個(gè)好的引物合成單位；②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度；③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效；④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠引物之間形成二聚體等，需重新設(shè)計(jì)引物。（4）Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。對(duì)策：調(diào)整Mg2+濃度，從1mM到3mM，確定對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì)的最佳鎂離子濃度。注意：對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子濃度。（5）反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要摸索條件，否則容易失敗。（6）物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。對(duì)策：優(yōu)化PCR溫度，有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。（7）靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 可能原因：（1）引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。對(duì)策：需重新設(shè)計(jì)引物。（2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。對(duì)策：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。對(duì)策：可用巢式PCR方法來減輕或消除。 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：（1）引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。（2）Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。（3）酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。對(duì)策：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。⑤降低Mg2+濃度。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶可能原因：酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多。對(duì)策：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。2 RTPCR反應(yīng) 在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RTPCR產(chǎn)物可能原因：（1）RNA被降解對(duì)策：①在用來驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA，使用良好的無污染技術(shù)分離RNA；②在將組織從動(dòng)物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲(chǔ)存RNA；③如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在≥ DTT時(shí)加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。（2）RNA中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)策：通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行清洗?？梢约尤胩窃ǎ┮詭椭×繕悠稲NA的恢復(fù)。（逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。）將對(duì)照RNA同樣品混合，同對(duì)照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢驗(yàn)抑制劑。（3）多糖同RNA共沉淀對(duì)策：使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。（4）用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火對(duì)策：①確定退火溫度以適合引物。對(duì)于隨機(jī)六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25℃保溫10分鐘。②對(duì)于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機(jī)六聚體。③確定GSP是反義序列。（5）起始RNA量不夠?qū)Σ撸涸黾覴NA量。對(duì)于＜50ng的RNA樣品。（6）RNA模板二級(jí)結(jié)構(gòu)太多對(duì)策：①將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火。②提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，對(duì)SuperScriptⅡ可以到50℃，對(duì)ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃時(shí)使用oligo(dT)引物，選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP。對(duì)于＞1kb的RTPCR產(chǎn)物，保持反應(yīng)溫度≤65℃。不要在高于37℃時(shí)使用MMLV。③如果不需要全長cDNA，在第一鏈反應(yīng)中使用隨機(jī)引物。（7）引物或模板對(duì)殘余的RNA模板敏感 對(duì)策：在PCR前用RNaseH處理。（8）靶序列在分析的組織中不表達(dá) 對(duì)策：嘗試其他靶序列或組織（9）PCR沒有起作用對(duì)策：對(duì)兩步法RTPCR，不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物。 污染造成假陽性可能原因：（1）樣品間的交叉污染對(duì)策：①收集樣品的容器最好使用一次性的，如重復(fù)使用，應(yīng)在使用前應(yīng)于180℃的高溫下干烤6小時(shí)或更長時(shí)間；②樣品存放時(shí)要密封嚴(yán)實(shí)，以防外溢造成相互間的交叉污染；③樣品在提取過程中離心管及吸樣槍頭最好使用一次性的，以免不同實(shí)驗(yàn)樣品間相互污染；④由于吸樣槍污染會(huì)導(dǎo)致樣品