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目的基因的表達ppt課件(編輯修改稿)

2026-05-26 03:06 本頁面

　

【文章內容簡介】根據實驗觀察，隨著重組體克隆基因表達水平的上升，寄主細胞的生長速率便會相應地下降，同時形態上也會出現一些明顯的變化，例如細胞纖維化和脆弱性增加等。如果細菌由于產生出某種突變而失去了重組質粒，或是經過結構的重排使重組基因無法再行表達，或是質粒的拷貝數大大降低，那么這樣的突變菌株便會有很高的生長速度，迅速地成為培養物中的優勢菌株。而具有重組質粒的寄主細胞，最終便會被“稀釋”掉，使克隆基因無法得到表達。由缺陷性分配引起的質粒丟失現象，叫做質粒分離的不穩定性。（ 6）提高翻譯水平常用的途徑 ①調整 SD序列與 AUG間的距離； ②用點突變的方法改變某些堿基； ③增加 mRNA的穩定性。細菌的 mRNA的半衰期很短，一般僅為 1～ 2min，而外源基因mRNA的半衰期可能更短。若能增加 mRNA的穩定性，則有可能提高外源基因的表達水平。研究表明，大腸桿菌的 “ 重復性基因外回文序列 ” 具有穩定 mRNA的作用，能防止外切酶的攻擊。因此，在外源基因下游插入此序列或其他具有反轉重復順序的 DNA片段可起到穩定 mRNA、提高表達水平的作用。（ 7）減輕細胞的代謝負荷外源基因在細菌中高效表達，必然影響宿主的生長和代謝；而細胞代謝的損傷，又必然影響外源基因的表達。合理地調節好宿主細胞的代謝負荷與外源基因高效表達的關系，是提高外源基因表達水平不可缺少的一個環節。 ①誘導表達，使細菌的生長與外源基因的表達分開。將宿主菌的生長與外源基因的表達分開成為兩個階段，是減輕宿主細胞代謝負荷的最為常用的一個方法。一般采用溫度誘導或藥物誘導。例如應用 tac啟動子時，常用 F39。tac4的菌株或者將 Lac I基因克隆在表達質粒中。當宿主菌生長時， Lac I產生的阻遏物與 Lac操縱基因結合，阻礙了外源基因的轉錄及表達，此時，宿主菌大量生長。當加入誘導物 (如 IPTG)時，阻遏蛋白不能與操縱基因結合，則外源基因大量轉錄并高效表達。減輕細胞代謝負荷的方法 ②表達載體的誘導復制，減輕宿主細胞代謝負荷的另一個措施是將宿主菌的生長和表達質粒的復制分開。當宿主菌迅速生長時，抑制質粒的復制；當宿主菌生物量積累到一定水平后，再誘導細胞中質粒 DNA的復制，增加質粒的拷貝數，拷貝數的增加必然導致外源基因表達水平的提高。例如質粒 pCll01的溫度控制誘導復制。用此質粒轉化宿主菌， 25℃ 時宿主中僅有 10拷貝，宿主細胞大量生長；當溫度升高到 37℃ 時，質粒大量復制，每個細胞中質粒拷貝數可高達 1000個。減輕細胞代謝負荷的方法 ①克隆一段原核序列，表達融合蛋白。 ②采用某種突變菌株，保護表達蛋白不被降解。例如大腸桿菌蛋白酶的合成主要依賴次黃嘌呤核苷 (lon)，因此采用 lon缺陷型菌株作受體菌，則使大腸桿菌蛋白酶合成受阻，從而使表達蛋白得到保護。 ③表達分泌蛋白 (運用分泌型表達載體 )。（ 8）提高表達蛋白的穩定性，防止其降解第三節真核表達體系的特點與外源基因在真核細胞表達利用真核細胞作宿主表達系統的優點 1）真核細胞具有一系列剪切酶，能夠識別和除去外源基因中的內含子，剪接加工形成成熟的 mRNA。含有內含子的天然基因在真核細胞中是可以利用的，這是原核細胞辦不到的，它不像原核細胞表達體系那樣必須從 mRNA制備 cDNA。利用真核細胞作宿主表達系統的優點 2）真核細胞將表達的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達的蛋白是沒有糖基化的，糖基化對某些表達蛋白的免疫原性影響很大，有利于保持或提高目的蛋白的免疫原性。真核細胞作宿主表達系統存在問題 1) 選擇標記及選擇系統只有少數幾個； 2) 外源基因導入真核細胞效率（轉化率）較低，一般只有 106～ 104； 3) 外源基因轉移并整合到細胞染色體 DNA上帶有一定的自發性和盲目性，整合的拷貝數和位置都還不能控制； 4) 細胞培養及細胞的挑選要求比較高，手續繁瑣費時，細胞大量培養還有不少問題，而且成本較高。真核細胞作宿主表達系統存在問題第四節酵母表達體系酵母表達系統已被成功地用于生產人類、動物、植物或病毒來源的異源蛋白，獲得了一些用傳統方法無法得到的異源蛋白，還可對醫藥相關的蛋白結構和功能進行研究，如對重組蛋白進行研究，設計和篩選藥物。 ① 酵母能像細菌一樣在廉價的培養基上生長，方便地用于外源基因的操作； ② 作為真核生物，它提供轉譯后加工和分泌的環境，使得產物與自然蛋白一樣或類似； ③ 可將異源蛋白與 N端前導肽融合，指導新生肽分泌，在分泌中可對表達的蛋白進行糖基化修飾；酵母宿主用于表達高等真核生物重組蛋白的優點 ④ 采用高表達的啟動子，如 MOX、 AOX、 LAC4等基因的啟動子，而且可誘導調控； ⑤ 酵母能像高等真核生物一樣移去起始甲硫氨酸，這樣可避免在作為藥物使用中引起免疫反應的問題； ⑥ 酵母細胞也可進行 N乙酰化、 C甲基化，對定向到細胞膜的蛋白表達有重要作用。酵母宿主用于表達高等真核生物重組蛋白的優點一．釀酒酵母中外源基因的表達第一個用于生產重組蛋白的酵母為釀酒酵母（ S. cerevisiae）。要在酵母中最大限度表達基因，需要特異的啟動子（乙醇脫氫酶、同工酶 Ⅰ 、磷酸甘油激酶、酸性磷酸酶和 α 因子等基因的啟動子）。通過重組 DNA技術，可以利用釀酒酵母生產醫用的外源蛋白。用酵母生物技術方法得到的第一種醫用產品是乙型肝炎疫苗。其他類似產品包括組織型血纖維蛋白溶源激活因子、胰島素和水蛭素。由于釀酒酵母不能識別和處理高等真核內含子，因而須使用 cDNA。酵母生產外源蛋白的最佳表達盒包括有效的啟動子序列（可為誘導性或組成性），目的蛋白 cDNA和轉錄終止序列。使用釀酒酵母表達系統需考慮問題： ①啟動子和終止子的選擇； ②表達盒的穩定性； ③

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