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蛋白質復性ppt課件(編輯修改稿)

2026-05-30 06:01 本頁面

　

【文章內容簡介】 IL11；一般說來，在優化的條件下，大多數蛋白質體外復性效率在 20%左右 2）蛋白質的復性濃度 I向 N的轉化是一級反應，而聚沉是二級或多級反應聚沉的反應速度與蛋白質濃度的平方或高次方成正比而復性反應過程與蛋白質濃度的一次方成正比，故濃度越大，聚沉反應越明顯。 →復性時蛋白質濃度宜低（低濃度時，獲得的蛋白質復性效率比高濃度要好的多）濃度過低又給后處理帶來不便，一般選擇 10－ 100μg／ ml，以避免分子間相互作用力引起聚集。 ? 3）變性劑濃度和復性時間 ? 在高濃度變性劑存在時，蛋白質主要以 U存在（ 6mol/L 鹽酸胍、8mol/L Urea等）；在中間濃度時（較低濃度的鹽酸胍和Urea），主要以 I存在，即能抑制蛋白質分子間的疏水相互作用，又不會妨礙蛋白質分子內疏水相互作用的形成。 ? 由于 I向 N轉化是一個慢的過程，當蛋白質在此時放置較長的一段時間， I就可以慢慢地向 N轉化 ? 4）氧化還原環境 ? 復性不僅要降低或去除變性劑，同時必須提供 SH氧化形成 SS的環境 → 合適的氧化還原環境 ? 采用配對的氧化型和還原型巰基物質 ? 配對低分子量巰基試劑包括 GSSG/GSH、半胱氨酸或巰基乙醇 /胱氨酸等。通常還原型巰基物質的使用濃度為 l~3mmol/L，還原型 /氧化型的摩爾比為 10： 1或 5： 1。 5） pH和溫度最適宜的復性 pH值應大于（一般），以防止自由 SH的質子化作用影響正確配對的 SS的形成。應避免在蛋白質 pI處進行復性（蛋白質的靜電排斥力幾乎為零，相互間疏水作用區域就容易作用而形成 A）。溫度過高，蛋白質的聚集將十分嚴重，低溫下聚集和折疊反應都很慢，隨著溫度的上升二者的速度都加快 →常在室溫下進行 6）折疊促進劑能夠促進蛋白再折疊的化學物質統稱為折疊促進劑，折疊促進劑的作用原理在于穩定復性蛋白質的天然結構、抑制肽鏈間的疏水相互作用。應用于蛋白質復性并具有顯著效果的折疊促進劑有表面活性劑、聚乙二醇 PFG、 L－精氨酸、抗體、分子伴侶等。例：人 ?干擾素的后處理工藝發酵液離心 (發酵液冷卻至 10?C以下， 4000r/min離心 10min) 菌體細胞破碎 (1倍體積細胞 +10倍體積 PBS buffer, 冰浴超聲破碎 5次 , 30s/次 , 4000r/min離心 30min)，洗滌 (% Triton X100溶液， 1000r/min離心 20min，重復三次 ) 包涵體提取變性 (包涵體 +8M 尿素 pH 50mM TrisHCl buffer mM EDTA, 10mM DTT室溫攪拌 2h, 離心 (15000r/min, 30min) 例：人 ?干擾素的后處理工藝變性蛋白液稀釋 (取 1份變性液 +99份上述 buffer(不含 DTT與尿素 )，使尿素終濃度小于， 4?C下攪拌 24h）復性液濃縮 (用截留 10kDa的超濾器濃縮 100倍 )，透析后離心(15000r/min離心 30min) 濃縮上清液 Sephacryl s200柱層析分離：層析柱 2?100cm， pH 50mM TrisHCl buffer 平衡洗脫稀釋 \透析 \超濾復性法折疊促進劑協助復性法：表面活性劑、 PEG、分子伴侶等反相膠團復性法、雙水相體系復性法層析折疊復性（固相復性）：凝膠過濾層析（ GF）、親和層析（ AFC）、離子交換層析（ IEC）、疏水層析（ HIC）等蛋白質復性時聚集反應的抑制復性中最重要的是抑制復性過程的聚集反應。最常用的是使用聚集反應的抑制劑，其原理為： ? 穩定正確折疊蛋白質的天然結構， ? 降低錯誤折疊蛋白質的穩定性， ? 增加折疊復性中間體的溶解度， ? 增加非折疊蛋白質的溶解度， ? 減少復性中間體接觸發生聚集反應。聚集反應抑制劑的種類： 1. 可促進蛋白質折疊的小分子添加劑，如鹽酸胍或尿素，以及一些離液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺類化合物等。在非變性濃度下，是很有效的促進劑。 2. 對于某些需要輔因子才表現活性的蛋白質，

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