正文內(nèi)容

基因操作ppt課件(編輯修改稿)

2026-06-08 03:38 本頁面

　

【文章內(nèi)容簡介】酚氯仿蛋白變性劑，進一步抽提 DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會殘留在 DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化 DNA)。 ⑦乙醇：用于沉淀 DNA。 DNA分子以水合狀態(tài) “ 溶于 ” 水里，乙醇能奪去 DNA分子的水環(huán)境。 centrifugation pellet cell CsCL gradient purification Restriction digests ? Identified in the 1960s and early 1970s ? Bacterial enzymes which cut DNA into defined and reproducible fragments ? Key discovery which allowed the DNA cloning to bee a reality ?20世紀 60年代和 70年代初鑒定 ?來自細菌，可將 DNA酶切成特定的、可再生的片段。 ?其發(fā)現(xiàn)及鑒定是實現(xiàn) DNA克隆的關鍵。 ?Restriction endonuclease ?限制性內(nèi)切核酸酶：存在于細菌細胞中的一種識別一小段對稱的 DNA序列，在識別位點處切割（水解）雙鏈DNA骨架的酶。 ?識別序列： 4～ 8 bp的回文序列； ?特異性高： ?酶切產(chǎn)物： 3’或 5’突出末端或平頭末端。新形成的 5’ P, 3’ － OH。 Gel Electrophoresis ① 帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動，速度稱為電泳遷移率 ② 電泳遷移率同電場的強度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。 ③ 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。 ④ 摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關。 ⑤ 如果電場強度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同：電泳的基本原理電泳遷移率主要取決于分子本身的大小和形狀。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關 : 分子量越大，移動越慢。瓊脂糖凝膠電泳 ?瓊脂糖一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。 ?瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體 “ 胨 ” 。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高空隙小 ?瓊脂糖凝膠的分辨力 Agrose: a polysaccharide derived from seaweed, which forms a solid gel when dissolved in aqueous solution (%3%) 核酸在凝膠中向正極移動？核酸具有很強的負電性。 ① 檢測 DNA ②分離、純化目的 DNA片段 ③分析重組質(zhì)粒應用凝膠染色染料溴化乙錠 Ethidium bromide （ EB）原理 ?扁平分子，能插入 DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結合。 ?EB在 300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示 DNA泳帶在凝膠中所處的位置 . ?熒光強度與 DNA含量及大小成正比。在有 5’末端磷酸基團時， DNA連接酶可共價連接互補配對的黏性末端或平頭末端。 Ligase：由 ATP水解提供能量，將 dsDNA切口處 5’－磷酸與 3’－羥基相結合 DNA ligation Transformation ?感受態(tài)細胞 (ponent cell)：用 Ca2+ 溶液處理后易于吸收外源 DNA的大腸桿菌細胞。用于制備感受態(tài)的大腸桿菌細胞是不能表達限制修飾系統(tǒng)的特定菌株。 ?轉化：感受態(tài)細胞吸收外源 DNA（質(zhì)粒）的過程。 ? Transformantion efficiency: number of antibioticresistant colonies formed （ on a select plate）per microgram (mg) of input plasmid DNA. Ranges from 103/μg to more than 108/μg. 105/μg is adequate for a simple cloning. ?Heatshock: After the DNA is uptaken, the cells shall be put at 42oC for 1 min in order to induce the suppressed enzymes for cell defending ， which allow the cells to recover from the unusual condition of the transformation progress, and increase the efficiency. 轉化效率：每毫升用于轉化的質(zhì)粒 DNA在選擇平板上所形成的具抗生素抗性的菌落數(shù)。轉化率的變動幅度從粗放轉化程序 103/μg ~ 精細轉化程序 108/μg。熱激： 42oC熱激 1~2分鐘。誘導與 DNA修復有關的酶及其它細胞成分的生成。有利于細胞從轉化過程中的不正常狀態(tài)下恢復過來，提高轉化效率。 selection Distinguish between the recreated vector and religated vector is very important. 鑒別環(huán)化載體分子與重組質(zhì)粒是分子克隆中非常重要的步驟。 ?雙抗生素抗性篩選 ?藍－白斑篩選 ?Twin antibiotic resistance ?Bluewhite screening ?半乳糖苷酶 Xgal顯色反應

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