腎內(nèi)科臨床技術操作規(guī)范(編輯修改稿)

　

【文章內(nèi)容簡介】 小管：分別計數(shù)皮、髓質(zhì)各50個腎小管，分別乘以2再求其百分數(shù)。【石蠟切片免疫組化】1．標本處理(1)標本固定(升汞一苦味酸固定液)A液：飽和氯化汞4．5ml甲醛0．5ml(臨用時混合)B液：苦味酸飽和溶液組織取好后，先放入A液中5min，再將組織轉(zhuǎn)入B液2．5ml中5h至過夜。(2)脫水①75％乙醇10min洗苦味酸。②90％伊紅乙醇10～15min。③95％乙醇10～15min。④將組織塊用擦鏡紙包好，放人無水乙醇(優(yōu)級醇)10min2，中間搖動數(shù)次。(3)透明：將組織塊放入氯仿中10min2，10min后更換氯仿。(4)浸蠟：將透明過的組織投入蠟工(60℃，不含松香)20～30min，再移至蠟Ⅱ(60℃，含少許松香)1～1．5h。(5)包埋、切片：將浸過蠟的組織包埋成蠟塊，切片時將蠟塊凍人液氮罐中l(wèi)min，取出切片lμm厚，蠟片漂浮于35℃水中，貼片后62℃烤片5min，冷卻待用。2．石蠟切片PAP四層法染色(1)將石蠟切片脫蠟入水，先人二甲苯工、Ⅱ缸，各10min，再入無水乙醇、95％乙醇、75％乙醇各10min，將切片浸入水中。(2)如需要0．05％胰蛋白酶消化5min，水洗。(3)PBS洗片。(4)10％FCS室溫20min。(5)加工作濃度的特異性單克隆抗體室溫過夜。(6)余后處理完全同冰凍切片染色法。四、腎活檢標本電子顯微鏡超薄切片的制備技術電子顯微鏡觀察腎穿刺組織超微結構是腎臟疾病診斷及科研工作的重要內(nèi)容之一。電鏡觀察的成功與否與標本制備的質(zhì)量密切相關，因此，必須十分重視電鏡標本制備技術。超薄切片是電鏡工作中重要的一環(huán)，包括取材、固定、脫水、浸透和包埋、切片、染色等步驟，現(xiàn)將超薄切片的步驟和要求分述如下。【取材】1．要求 取材必須強調(diào)快、小、準、低溫操作、避免拉傷。(1)快：所取材料力求保持在生活狀態(tài)中，因此，應爭取在穿刺組織取出后半分鐘內(nèi)固定。(2)小：電鏡固定液對組織的穿透能力較弱，故組織塊大小以不超過1 mm3為宜。(3)準：電鏡觀察有一定的局限性，若標本中無腎小球則難以提供診斷意見，因此應注意取材準確性。合格的電鏡標本中應含有1個以上的腎小球。(4)低溫操作：血供停止后，組織和細胞內(nèi)各種酶的活動迅速造成組織自溶。為了避免這種現(xiàn)象，需在0～4℃操作，夏季最好將組織放在冰塊上操作，所用器械應先預冷。(5)避免拉傷：組織被牽拉和擠壓將直接影響觀察效果，所以，取材應選用鋒利的器械，操作時切勿牽拉或擠壓組織。2．步驟 將蠟板置冰塊中，滴上冷(4℃)的電鏡固定液，將腎活檢組織迅速放人蠟板上的固定液中，并用鋒利的刀片切成Imm3的小塊，然后移入清潔的小瓶中，確保組織塊全部浸沒在固定液中，加蓋，4℃下固定。【固定】固定的目的是為了在分子水平上保存生物細胞的每一細節(jié)，使其最大限度地接近生活狀態(tài)，盡量減少“死后變化”，以利于電鏡下的觀察、判斷。1．固定方式 分物理和化學固定兩種方式，生物組織和細胞的固定多選用化學方法。即一定的化學試劑和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生化學結合形成交聯(lián)，穩(wěn)定蛋白質(zhì)，并保存脂肪、糖類、借此來固定細胞結構，使它們處于生活狀態(tài)時的位置。2．固定劑的選擇 理想的固定劑應具備：能迅速、均勻地滲入到組織內(nèi)部；較好地穩(wěn)定各種結構成分；保存一定的酶活力；不使細胞收縮或膨脹；沒有人工假象，以保證電鏡圖像的真實性。此外，固定劑的pH、滲透壓及電解質(zhì)也與其固定效果有直接的關系。3．常用的固定劑 (1)戊二醛(glutaraldehyde C5H8O2) 用它固定的組織結構細膩，成分喪失少。其結構式為O—CH—CH2：一CH2一CH2一CH—O，一般配成3．75％的溶液(pH7．2～7．4)置4℃冰箱中備用，標本固定時間為4℃2h。①戊二醛固定液的配制方法0．2mol／L磷酸緩沖液A液 Na2P042H2 O 35．61g雙蒸水加至1 000mlB液 NaH2P04H20 27．6g雙蒸水加至1 000ml0．2 mol／L磷酸緩沖液25℃ pH A液 B液7．2 36．0ml 14．0ml7．3 38．5ml 11．5ml7．4 40．5ml 19．5ml戊二醛固定液3．75％(戊二醛+雙蒸水)：磷酸緩沖液一1：1(15ml+35m1)：50ml===1．1戊二醛加入后pH略有下降②戊二醛的主要優(yōu)點：對組織的穿透力較強、較快；與細胞有很強的親和力，對糖原、核蛋白，尤其是微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞膜基質(zhì)都有較好的固定作用；能保存某些酶活性，適于進行細胞化學研究；組織塊在其冷溶液中可以保存數(shù)周至數(shù)月而微細結構不發(fā)生改變。③戊二醛的缺點：沒有“電子染色”的作用，經(jīng)它單獨固定的標本反差很弱；對脂質(zhì)作用很差，脫水后大部分脂質(zhì)會被抽取；不影響細胞滲透壓，故對緩沖液滲透壓要求很高。(2)鋨酸(osmium tetroxide 0sO4)鋨酸又稱四氧化鋨。它是一種淡黃色結晶體，水溶液是中性，具有很強的揮發(fā)性和毒性。鋨酸是貴重、優(yōu)良的電鏡標本固定劑。一般用它作后固定。固定時間因組織不同而異，一般1～2h／4℃。①鋨酸固定液的配制：將市售淡黃色結晶狀的鋨酸安瓿(0．5g，1．0g兩種)洗凈，放入清洗干凈的棕色磨口瓶內(nèi)，蓋緊瓶塞，振破安瓿，放入一定量蒸餾水，配成2％水溶液(鋨酸1g加人500ml蒸餾水)，置2d后待其完全溶解成無色透明或淡黃色清液方可使用。臨用時取此液加等量的O．2mol pH7．4的緩沖液，使成1％溶液。②鋨酸的主要優(yōu)點：是一種強氧化劑，對氨具有很強的親和力，幾乎能和所有細胞成分結合，較完好地保存細胞微細結構；能與不飽和脂肪酸結合，形成脂肪一鋨酸復合物，是唯一能夠固定脂類物質(zhì)的固定劑；較好地保存核蛋白；本身密度高，產(chǎn)生良好的電子反差，彌補戊二醛固定的不足；對緩沖液要求不嚴格；在固定時間合適的情況下，不會使固定組織變硬變脆及收縮和膨脹，便于以后超薄切片。③鋨酸的缺點：分子較大，滲透力弱，組織塊若超過1mm3，固定效果則差，引起固定不均勻；對糖原、核酸及微管固定差，不適于進行細胞化學工作；標本長時間停留在固定液中會使組織變脆，造成切片困難；揮發(fā)性和毒性大，對人體有害。戊二醛和四氧化鋨各自存在著許多優(yōu)、缺點，共同固定可互補對方的不足。因此，現(xiàn)在多采用戊二醛作前(預)固定，鋨酸后固定，此即雙固定法。腎穿刺標本取材不易，超微結構觀察要求細致，保存細胞成分越多越好，一般均選用戊二醛一鋨酸雙固定。固定液用量一般為標本的40倍。醛類和鋨酸混合后會起氧化還原反應，形成還原鋨沉淀。因此，標本經(jīng)戊二醛作固定后必須充分水洗，并用磷酸緩沖液清洗數(shù)遍。除上述兩種固定液外，還可用4％多聚甲醛及高錳酸鉀作電鏡固定液。4％多聚甲醛經(jīng)濟、易得，不受條件限制，固定效果較接近戊二醛；高錳酸鉀對磷脂類固定效果好，適于保存細胞膜結構。但腎穿刺組織一般不采用這兩種固定液。4．固定的步驟 常規(guī)使用3．75％冷戊二醛作預固定，通常在4℃下固定2h或過夜，O．1mol／L的磷酸緩沖液沖洗后1％鋨酸作后固定，一般4℃下固定1．5～2h。【脫水】電鏡包埋材料大多是不溶于水的，為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必須用一種水及滲透液均能相溶的惰性液體來取代水，將組織內(nèi)水分驅(qū)除干凈。一般用一系列濃度的乙醇或丙酮進行脫水。脫水液量與組織塊之比大于1：20倍，室溫下操作。為便于包埋劑滲透，在脫水之后包埋之前可加入環(huán)氧丙烷(propylene ox—ide)作中間溶劑；為提高樣品反差，也可在70％乙醇脫水過程中加醋酸鈾進行組織塊染。具體步驟：采用丙酮脫水劑，由低濃度開始，逐漸增加濃度，一般由30％、50％、70％、90％、100％逐漸遞增，每級10～15min，純丙酮脫水45min(每15min換液1次)。脫水應充分，否則可造成包埋劑浸透不全、聚合不好等，影響切片質(zhì)量。【浸透、包埋及聚合】包埋劑為液體介質(zhì)，它可以滲入組織取代脫水液，并能在一定溫度下聚合，硬化成固體，有足夠的彈性作為細胞支架，使細胞能承受超薄片，耐受電子束轟擊。理想的包埋劑應黏度較低，易滲入組織，對組織不起化學反應，能溶于脫水劑；聚合均勻、充分，不產(chǎn)生體積收縮；軟、硬度適中，容易切片；透明度好，不產(chǎn)生前景反應，材料來源豐富，操作簡便。目前廣泛應用的包埋劑是環(huán)氧樹脂Epon812，這是一種熱塑性樹脂，微黃色液體，黏度較低(25℃150～120厘泊)，它和一定量的硬化劑作用后，在一定溫度下形成不可逆交鏈的黃棕色固體。硬化劑一般都用二酸酐類，它起交鏈、固化作用。Epon812的優(yōu)點是能夠保存組織的細微結構。1．配制包埋劑注意事項 ①包埋劑配制要準確無誤，尤其是DMP30；②包埋劑攪拌要充分，依次按時加入；DMP30需緩慢加入，并至少攪拌10min使其充分混合；③加入硬化劑時勿加溫，以免發(fā)生提早聚合；④操作時注意防潮，應在相對濕度40％以下的密閉操作箱內(nèi)進行，以防造成包埋介質(zhì)渾濁，聚合不勻，硬度和彈性不當?shù)取?．浸泡、包埋、聚合過程(1)浸泡：脫水后的標本，移人包埋劑與純丙酮l：l中30min以上，再移人2：1中3h，人純包埋劑3h。(2)包埋：取1號或2號藥用透明膠囊，內(nèi)放標本號，烤干，注入包埋劑，再放樣品于膠囊中央，樣品會逐漸下沉到膠囊底部，移人烤箱，37℃12～24h，45℃12h，60℃12～24h聚合。包埋劑多用環(huán)氧樹脂，配法如下：A液：Epon812 62ml B液：Epon812 100mtDDSA 100ml MNA 89ml改變A液和B液的比例則可調(diào)節(jié)聚合塊的硬度，A液多則軟，B液多則硬。可視組織的硬度和氣候不同調(diào)節(jié)其比例。臨用時取A、B液按下列比例配好后，通常冬天A：B＝3：7或4：6或5：5；春秋A：B＝2：8；夏天A：B＝1：9。試劑名稱：Epon812 環(huán)氧樹脂 812DDSA 十二烷基琥珀酸酐(硬化劑)MNA 甲基內(nèi)次甲基四氫苯二甲酸酐(硬化劑)DMP30 2，4，6一三(二甲氨基甲基)苯酚(加速劑)聚合好的膠囊是微黃(棕)色固體，透明、均勻、無氣泡；組織塊位于膠囊底端中心。【修塊定位及步驟】1．修塊 聚合好的包埋塊，固定在樣品夾中，在解剖顯微鏡下，用銳利的刀片小心地修去頂部及周圍的包埋介質(zhì)，暴露出組織來，再把組織塊四周的包埋介質(zhì)修成四面錐體，組織塊表面要修平整，根據(jù)組織大小修成各種形狀，上下邊緣最好互相平行，如梯形、長方形或正方形等，大小約lm㎡。可切去一角留作記號，以方便定位。2．定位 因電鏡僅能觀察某(幾)個細胞形態(tài)及內(nèi)部微細結構，超薄切片亦只能切0．04～0．09m㎡，故準確定位非常重要。腎穿刺組織定位更是如此。如定不到腎小球則意味著整個過程失敗。3．步驟 將修好的組織包埋塊在超薄切片機下切成0．5～1／μm的切片，經(jīng)甲苯胺藍染色后在光學顯微鏡下觀察，選取合適的小球及病變部位，修去多余的組織。修時選用鋒利刀片，邊要直，角要銳，便于超薄切片。甲苯胺藍染色：半薄切片用O．5％甲苯胺藍水溶液染色約lmin(可在火焰上加溫，待看到水汽時停止)，水洗，鏡下定位。【超薄切片】 ．切片是樣品制備過程中技術性較強的一環(huán)，可按如下條件、步驟操作。1．載網(wǎng)與支持膜 超薄切片的載網(wǎng)是具有透明支持膜的銅網(wǎng)，圓形，直徑大多為3mm，網(wǎng)孔一般有50～300目，可有正方形、圓形，亦可有單孔，可根據(jù)試驗不同而加以選擇。支持膜一般用Formvar(聚乙烯醇縮甲醛)膜，它具有相當好的機械強度和透明度，若復以碳膜可更堅固。另有火棉及碳膜、微篩膜等，各有其所長。Formvar膜的制備：制膜濃度可從0．2％～0．5％，做膜前，將新銅網(wǎng)浸入無水乙醇中清洗，濾干后備用。將干凈玻片插入Formvar液中，立即提起，垂直放置待干，膜干后漂于蒸餾水面，放上銅網(wǎng)，濾紙撈起。2．切片刀 超薄切片需要特殊的切片刀——玻璃刀或鉆石刀。玻璃要求很高，厚5～8 mm，硬度要合適；制作玻璃刀一般用專門的制刀機，制刀要求干凈，角度合乎標準，刀口銳利等，切片刀的優(yōu)劣直接影響超薄切片。鉆石刀更為優(yōu)良，可切出10～20mm的切片，使用壽命更長，但價格昂貴而不常用。3．超薄切片機 我們使用的是瑞典LKB一Ⅱ型超薄切片機，它能切出半薄和超薄切片，切片厚度能控制在5～200nm，還可根據(jù)需要自動調(diào)節(jié)，切出厚度均勻的連續(xù)切片帶。4．超薄切片術 超薄切片的質(zhì)量與玻璃刀、架刀角度、收集槽液面、組織塊硬度、組織的固定、脫水、包埋過程以及包埋塊的修整，切片機性能和操作者的責任心等因素有密切關系。操作基本過程為開機一固定組織塊一架刀一手動修塊一注水槽一自動連續(xù)切片一收集片一撈片。切片時尚需有適當?shù)臏囟群蜐穸龋?0℃，濕度60％以下為佳。超薄切片比較合適的厚度為40～60nm，切片越薄，分辨率越高，對比度則越低。切片的厚度由于涉色估計，其顏色與厚度的關系如下：干涉色 切片厚度(nm)灰色 50銀白色 50～70金黃色 70～90紫色 90選灰色和銀白色的切片撈于有膜銅網(wǎng)(或鎳網(wǎng))上，一般支持膜厚10～20nm，無結構，耐電子轟擊，不起化學反應。【染色】透射電鏡標本染色是以組織和細胞染色后對電子散射的程度來顯示出不同的結構，需用重金屬與組織中某些成分結合或被吸附來達到染色目的。目前采用的是醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，以達到互補作用。1．染色的要求 理想染色劑的標準應是能夠增強反應；選擇性地使重金屬常沉淀在一定部位上；保持微細結構的完整性；不與固定劑發(fā)生不良反應；在室溫和正常大氣壓情況下，配制簡單，操作方便，染色均勻。 (1)醋酸鈾：又稱醋酸雙氧鈾，結構式為UO2(CH3COO)22H20，它可以和大多數(shù)細胞成分結合，易與核糖核酸顆粒反應，降低組織類脂的提取。pH對于醋酸鈾結合到生物各種基質(zhì)上的能力有很大影響，pH＞3．5時，雙氧鈾離子對DNA的親和力明顯增加。 (2)