手把手教你使用ipp(編輯修改稿)

　

【文章內(nèi)容簡介】 100象素，就只剩下16個細胞了。當(dāng)調(diào)整過濾數(shù)值時，圖片上的object標(biāo)志也會動態(tài)地顯示，過濾掉的object會立即消失。還有問題。圖片中有兩個細胞緊挨在一起的，被識別成一個object了。而另外還有細胞因為太暗，被識別成兩個甚至更多的object了。這只能用人工把它們分開或合并。在count/size窗口的edit菜單下，上面的幾個split命令就是用來分割連在一起的object的。auto split 與watershed split都是自動分割，操作簡單，但很少分成準確。split是手工分割，點此后出現(xiàn)一個小窗口，用鼠標(biāo)在相連的兩個object的連接處劃一條短線，將兩個分開，再點一下右鍵就行了。把圖片上所有相連的object全分割后再點一下小窗口的OK按紐。再回去count一遍，分割就生效了。limited watershed split也是手工法分割。這種分割方法是半自動的。道理有點象漲大水。兩個挨著的山峰，在山腳處是相連的，如果山下漲了洪水，這兩座山峰就會徹底被水隔開了。但是水漲多高才能把兩個山峰隔開呢？這個limited就是讓你自己掌握漲水的程度。以便分割得更準確。按照說明書的意思，需要輸入的數(shù)值是漲水最多淹沒多少象素的數(shù)值。有挨在一起的細胞，就有一個細胞被識別成兩個以上object的。用手工將它們合并的命令是Draw/merge objects。這跟split的操作類似，只是不劃線，而是畫一個圈，把幾個本應(yīng)在一起的Objects圍起來就行了。看到這里，是不是覺得很麻煩？鼓搗了半天，真還不如在顯微鏡下拿著計數(shù)器去數(shù)呢。其實這里的問題在于拍攝照片，如果能拍攝出清晰的細胞照片，沒有渣點，細胞分布也很均勻，用IPP來數(shù)密密麻麻的細胞還是能作到的。如果圖片中有兩類不同的細胞，IPP也能進行分類計數(shù)。class的意思就是分類。但前提是照片中的兩類細胞得有明顯的區(qū)別，比如顏色不同、大小不同或亮度不同。這個麻煩事以后再談吧。剛才的圖片中有一些比較暗的細胞沒有被計算進去，可見auto bright object并不靈驗，還得用segmentation工具來選色呀，看看這回的計數(shù)效果吧。具體作法大家當(dāng)作作業(yè)自己試試吧，我是用吸管工具來選色的，這張圖片大家很熟悉吧？里面有紅綠兩種顏色的細胞，可以用分類計數(shù)的方法同時對兩種細胞進行計數(shù)。計算結(jié)束是看range statistics。里面給出了兩類細胞的計數(shù)比例。好啦，這個主題就到此為止吧。如果你想用IPP來進行細胞計數(shù)的話，一定要照下清晰干凈的照片再來處理。否則會累死你。校正標(biāo)尺在你打算學(xué)學(xué)標(biāo)尺的操作并自己動手在自己電腦上玩玩標(biāo)尺之前，要確認自己是要動真格地學(xué)會怎樣設(shè)置這些東東。因為一旦標(biāo)尺設(shè)置錯誤了，以后所有的幾何測量數(shù)值都會出錯的。而且不會因為你關(guān)閉程序或關(guān)閉電腦就能Reset了。如果你因為在這里學(xué)著定標(biāo)尺而搞亂了你的IPP程序，可別埋怨我。 在前面的帖子中我一直沒提及標(biāo)尺，因此在提到測量面積直徑等幾何尺寸時都用象素作為單位。如果你需要測量微觀物體的準確幾何尺寸，那就得進行標(biāo)定操作后才行。 還有一個需要標(biāo)定的是光密度，這可就比幾何標(biāo)尺困難多了。對光密度進行標(biāo)定我覺得麻煩而且不準確，在實際應(yīng)用中我們一般都只測量相對的光密度對比，因此對光密度進行標(biāo)定實在是吃力不討好的事。所以關(guān)于光密度標(biāo)定的部分我也實在懶得費力去寫了。（修訂：這段話看來是大錯特錯了，光密度較正是必須要作的，否則在進行灰度分析時肯定會出錯，我在后面重新寫了一個相關(guān)的帖子）不過本論壇里曾有人討論過相關(guān)的內(nèi)容。 標(biāo)定標(biāo)尺還需要有個物質(zhì)準備，就是得有一個叫“微標(biāo)尺”的小玻璃片。上面刻有準確的刻度，在1MM的長度上刻著100個分度刻度。得在專業(yè)的顯微鏡生產(chǎn)商那才能買到，或者在買顯微鏡時把這個當(dāng)作附件給買下來。如果沒有這玩藝怎么辦？還真有點難辦。照理說如果有一個能放在載片上的尺寸已知的小東西也是可以的，這個東西首先得足夠小，其次得準確知道它的尺寸。我現(xiàn)在能夠想到的東西就是血球計數(shù)板。它的尺寸就是1平方毫米，分了幾個大格和小格，線條精度雖然比不上微標(biāo)尺，但誤差也不會太大。可以湊合著用。上面說的是使用顯微鏡照片時用的標(biāo)尺。如果你處理的是大個物體的照片，那就在物體邊上放個米尺就行了。在拍攝物體的同時也把米尺的圖象拍下來。 使用標(biāo)尺來標(biāo)定幾何尺寸的方案是這樣的：先用顯微鏡拍攝下微尺的圖象，再用顯微鏡拍攝下樣品顯微圖象，最后用微尺的圖象來“量”樣品圖象的幾何尺寸。在IPP中，程序先記住1MM相當(dāng)于多少象素，然后測量樣品圖象的幾何尺寸時只要先算出象素值，一換算就得了。 最重要的一點就是，現(xiàn)在的數(shù)碼相機都有無級變焦，可以任意放大縮小畫面。因此要特別注意，在拍攝微尺圖象與拍攝樣品圖象時，絕對不能調(diào)節(jié)相機的變焦（ZOOM）。 顯微鏡一般都有4倍、10倍、40倍、100倍甚至更多物鏡。可以分別用這些物鏡拍攝下不同的微標(biāo)尺圖象，在處理不同物鏡下拍攝的照片時使用各自對應(yīng)的標(biāo)尺。 具體的操作步驟如下：使用標(biāo)尺的第一步就是拍攝微標(biāo)尺的照片。拍一張是不行的。如果你的顯微鏡有4個物鏡分別是4X、10X、40X、100X，那么就要分別拍攝下這四個鏡頭下的標(biāo)尺圖象。如果你的像機是非變焦鏡頭，還不錯。不用管變焦的事。我的相機有五級變焦，其中光學(xué)變焦三級，數(shù)字變焦兩級。而三級光學(xué)變焦中，兩個短焦距變焦拍攝的圖象亮度不均勻，不能用。數(shù)字變焦不予考慮。因為我固定使用一個焦距。否則每個變焦都要拍攝標(biāo)尺照片。數(shù)碼相機拍攝畫面還有不同象素。分別是低、中、高三個檔次。三種象素畫面大小是不同的，因此也要分別拍攝它們的標(biāo)尺圖片。4個鏡頭，五種變焦，三種象素。共需拍攝4*5*3=60張不同的標(biāo)尺圖片。我偷懶，只拍攝4種鏡頭下各自的標(biāo)尺照片，相機變焦與象素選擇都只用一種。如果你的相機是無級連續(xù)變焦的，可得小心，得固定一個變焦值。圖中分別是100X、40X、10X物鏡下的微標(biāo)尺照片。 設(shè)置標(biāo)尺的菜單命令在measure carlibration spatial，彈出標(biāo)尺標(biāo)定的菜單來。1點擊菜單中的new按紐。新建一個標(biāo)尺，然后再最上面Name項下的spatial cal 0處點一下，改成40XlowR。這是新建標(biāo)尺的名稱。雖然名稱是可以隨便取的，但最好能反映拍攝條件，40X表示物鏡為40X，lowR表示數(shù)碼相機采用最低象素畫面格式。別用中文字符。這是標(biāo)尺單位，顯微鏡圖片用微米來計量長度單位最合適。當(dāng)然可以用別的，比 如KM作單位，圖片上一個小尺的長度就是幾千萬分之一公里。 when change unit選項，給勾上。，就立即彈出scaling對話框，同時在標(biāo)尺圖片左上角顯出一個標(biāo)尺，將鼠標(biāo)移到這個標(biāo)尺的橫杠上，點一下左鍵，光標(biāo)就立即變成了小手，就用這個小手把光標(biāo)拖下來，再將光標(biāo)分別移到移到橫杠的左右兩端，用左鍵拖這兩個端點到圖片兩邊的標(biāo)尺該線處。在這一步操作中，兩個端點位置必須準確。一個方法是點scaling中的放大鏡按紐調(diào)出放大窗口，可以看到鼠標(biāo)所在處的放大圖形。另一個方法是把標(biāo)尺的兩端放在短刻線的線頭處，這樣選點更準確。從下圖的兩個放大鏡圖象中可看出，端點在刻線中間時上下位置是沒法選準的。而在刻線頭處，上下左右都有參照，可以準確選中位置。在選端點位置時要盡量向兩邊拉，拉得越遠，誤差越小。，數(shù)一下兩個端點之間有多少間隔，這個微尺每格10um，兩端點間為二十小格，長度為200um，所以要在scaling里填上200。，回到spatial carlibration窗口。 大功告成了。點close關(guān)閉窗口結(jié)束。如果你覺得這個標(biāo)尺作得不對，得重作，可以重新打開窗口，在Name中選出這個標(biāo)尺，點image重新找端點。如果覺得不保險，就干脆點delete。關(guān)閉窗口，再打開它，剛才那個標(biāo)尺就沒有了，可以重新新建標(biāo)尺。重復(fù)上面的步驟，把10X與100X鏡下的標(biāo)尺也給標(biāo)定一下。窗口下面的幾個選項都不要動它，保留默認值。那些是較正圖象變形用的。誰敢說你用的顯微鏡或照相機有圖像變形，廠家會跟你急眼的。至少我現(xiàn)在用的olympus顯微鏡圖象沒有一點看得出來的變形設(shè)定了標(biāo)尺，就可以在圖片中應(yīng)用它了。 carlibration select spatial。或者點工具欄里的卡尺圖標(biāo)，就調(diào)出了標(biāo)尺選擇窗口。，點適用的那個。這樣就完成了標(biāo)尺的第一個作用：應(yīng)用了此標(biāo)尺后，測量出來的幾何數(shù)據(jù)就不是象素了，而是實際的幾何測量值（微米、平方微米等）下面再使用標(biāo)尺的第二個功能：往圖片上加標(biāo)尺標(biāo)記。再點擊marker按紐（不是點OK按紐）。這回彈出的是spatial calibration marker窗口。這兩種選擇的后續(xù)操作步驟居然不一樣！！！區(qū)別在于：一種標(biāo)尺是”燒進“圖象中的，加上標(biāo)尺的圖象已經(jīng)被改動了，另一種標(biāo)尺是浮在圖象上的，只能在IPP程序中看到，在別的程序中是看不到打上的標(biāo)尺的。具體方法下兩帖單獨講。長短要合適。如果尺的長度小于標(biāo)尺文字（10um這幾個字）長度，會很難看的，需要多試幾個長度，擇優(yōu)錄取。，就消不掉了，所以標(biāo)記上標(biāo)尺的圖片最好另存一張。！切記切記！否則長度肯定會標(biāo)錯的。當(dāng)Style樣式選用的是ONimage時，下面有四個不同的小尺形式。從中點一個選上，再選好小尺長度，點OK會彈出一個新窗口，圖片中也會出現(xiàn)小標(biāo)尺。它的位置就是上次選標(biāo)尺的位置。平時我們喜歡把小標(biāo)尺放在圖片下方，所以這個小標(biāo)尺經(jīng)常是出現(xiàn)在圖片下方的。繼續(xù)點continue回到標(biāo)尺選擇窗口（Active spatial calibration），現(xiàn)在就可以點OK關(guān)閉（可不能點marker按紐）標(biāo)尺選擇窗口了。從小標(biāo)尺出現(xiàn)在圖片上的時候開始，直到現(xiàn)在，你都可以用鼠標(biāo)左健拖動小標(biāo)尺，移動位置，到位后點一下右鍵就把它給定住了。至此就永久地標(biāo)上了小標(biāo)尺了。如果作錯了哪一步想從頭來，得先關(guān)閉圖片（一定要選擇不保存），關(guān)閉全部窗口，再重新來一遍。當(dāng)Style樣式選用的是Nondestructive時，下面有三個不同的小尺形式。從中點一個選上，再選好小尺長度，還可以自選標(biāo)尺的顏色（這是上一個方法里作不到的）。點OK進入下一步。現(xiàn)在出來一個continue窗口，標(biāo)尺及其文字也出來了。現(xiàn)在別著急點continue，在標(biāo)尺上用左鍵點一下，再用左鍵拖，把它移到位。文字與標(biāo)尺是分別拖的，這樣文字的位置可以靈活地放。標(biāo)尺和文字都拖到位后再點continue，一旦點了continue就不能后悔了。回到選擇窗口后點OK關(guān)閉。光看這些啰哩啰嗦的說明肯定記不住。只能自己操作幾遍才行。IPP的標(biāo)尺功能好象有點BUG，有時候真的不靈。打上的標(biāo)尺很難看。這是因為不管圖象的實際大小，顯示的圖象幾乎都是那么大，如果是一張大圖片，因為顯示時圖片被縮小了，所以標(biāo)尺也被縮小了，結(jié)果看上去文字與標(biāo)尺本身都顯得小而不清晰。其實如果用實際象素來顯示圖片的話，標(biāo)尺就會清晰了。如果你在IPP中設(shè)定了標(biāo)尺，就一定要設(shè)對，否則所有的計算結(jié)果都是錯誤的換算數(shù)據(jù)。而且IPP的記性非常好，即使你關(guān)閉程序了，關(guān)閉電腦了，它還是記得你設(shè)置了一個標(biāo)尺，下回你使用IPP時它還是自動地應(yīng)用這個標(biāo)尺，所以每次開始使用IPP的時候，一定要點一下工具欄里的卡尺按紐，選擇一下標(biāo)尺，如果不想應(yīng)用標(biāo)尺，就一定要選none。總之一定要選一個。即使你不想在圖片上打標(biāo)尺，也要選一下，因為各種幾何測量的值已經(jīng)被這個標(biāo)尺設(shè)置給換算了。設(shè)定了標(biāo)尺后，幾何測量值就不是象素值，而是換算成微米值了。所以如果你一旦動過IPP的標(biāo)尺設(shè)置，就一定要把這個主題給看明白，學(xué)會。否則你的數(shù)據(jù)幾乎肯定會出錯的。而且經(jīng)常是錯了還不知道錯在哪里。本主題到此結(jié)束。關(guān)于與光密度校準相關(guān)的操作，將在另外的主題中討論。幾何測量在上一主題我講了設(shè)定標(biāo)尺的方法，設(shè)定了標(biāo)尺后，還要選擇定義標(biāo)尺，才能測量幾何尺寸。因此在這一主題里的幾何測量中，首先定義標(biāo)尺是必須的。定義標(biāo)尺與在圖片上打上標(biāo)尺記號是兩回事。定義標(biāo)尺的操作并不在圖片上留下任何痕跡。但所有測量數(shù)據(jù)卻被換算成實際的長度數(shù)值了，而在圖片上打標(biāo)尺記號的操作也就自然地定義了標(biāo)尺。實際上在前面的count/size中的measure中，我們已經(jīng)作過許多幾何測量，比如測量各個AOI的面積，平均半徑，長寬比例。在那個select measurement窗口中除了一些光密度測量項目外，還有一長串的幾何測量選項可以運用。你們是否注意到，所有這些幾何測量項目都有一個共同的因素都是測量一個區(qū)域的幾何尺寸。因此，在點、線、面、體這四個方面，前面所能作到的 測量只包括了面的測量，所以我們還得知道一些點和線的測量方法。至于體的測量，現(xiàn)在還不敢想。隨便打開一張圖片玩吧，點measure measurements。主要的測量工具就在這里了。左上角的features框里就是這個工具能作的測量。最下面居然也有count/size，可見軟件商對這個count/size工具是多么得意。在這個框里找個測量項目點一下，就出來一個小對話框指導(dǎo)你該怎么操作。我挑幾個有意思的說說。最上面的點工具我們用過吧。其實那不是為了數(shù)數(shù)用的，而是測量點的位置的。用它在圖上點一個測量點后，這個點的坐標(biāo)就在旁邊的窗口里顯示出來了。當(dāng)你點曲線按紐時，出來的工具與AOI的irregular工具一模一樣。只是在選AOI時，它一定會走一個閉合曲線。這里它可以走一個任意形狀的曲線，也是可以自己拖，可以循邊界自動找。在自動找線時要先點左鍵讓它停下來，再點右鍵確認。量角度的兩個工具有啥區(qū)別?前一個畫著角線的工具是讓你在圖上自己畫兩條直線，測其角度。量角器那個工具是量圖上已經(jīng)有的兩條線之間的角度。那些已經(jīng)有的直線得是用上面畫直線的工具畫上去的。倒數(shù)第二排的測兩條線之間的距離的工具也是需要先用直線或曲線工具先在圖上畫好兩條線后才能使用。IPP也有說話不算話的時候。比如畫點擬合線時可以畫上很多點，然后點右鍵就出來了擬合直線。畫點擬合園或弧的時候分明說的是可以畫三個以上的點，結(jié)果點三個點就立即出來一個園或弧。當(dāng)你用這些工具在圖片上畫了一堆亂七八糟的線條后，只要點一下上面的叉按紐，就能消除掉它們了。右邊顯示的測量數(shù)值也可以傳到Excel。