國家高技術研究發展計劃(863計劃)課題中期執行情況報告(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 ）。青枯雷爾氏菌強致病力菌株與無致病力菌株最后的鑒別方法為利用番茄組培苗回接，統計發病率（圖 13）。 3青枯雷爾氏菌無 致病力菌株轉 GFP基因 為了觀察青枯雷爾氏菌無致病力菌株侵染植株的過程，對其進行綠色熒光蛋白（ GFP）基因轉化，轉化條件：質粒 pUTgfplux（ miniTn5）；培養基 LB培養基以及含有 50 μg/mL卡那霉素的 LB培養基。儀器 Bio－ Rad Gene Pulser II Leica MZ12（圖 14）。轉化后青枯雷爾氏菌無致病力菌株在熒光顯微鏡下顯示出綠色光，表明轉化成功（圖 15）。比較轉化 GFP前后的青枯雷爾氏菌無致病力菌株生物學特性，結果表明，其對通氣量要求無差異（圖 16），對初始 pH要求無差異 （圖 17），對溫度的適應無差異（圖 18），生長速度無差異（圖 19）。同時通過 PCR檢測到 GFP基因的存在。 10 圖 14青枯雷爾氏菌 GFP轉化質粒構建 圖 15青枯雷爾氏菌 GFP轉化 圖 16GFP轉化后青枯雷爾氏菌對通氣量要求相同 圖 17GFP轉化后青枯雷爾氏菌對 pH要求相同 圖 18GFP轉化后青枯雷爾氏菌對溫度要求相同 圖 19GFP轉化后青枯雷爾氏菌生長速度相同 4青枯雷爾氏菌無致病力菌株侵染特性 利用青枯雷爾氏菌轉 GFP無致病力菌株侵染番茄，可以在葉、莖、根部檢測到 GFP菌株的存在，用番茄芽，直接在紫外燈下可以見到整個芽發綠色光（圖 20）。對侵染特性研究表明，最佳接種濃度為 102以上（圖 21），最佳接踵溫度為 22℃ 以上（圖 22），最佳接種方法為灌根和剪葉法（圖 23）。利用利用青枯雷爾氏菌轉無致病力菌株（ 64）生產出免疫抗病接種劑 鄂魯冷特（圖 24），用于接種番茄盆栽苗，接種鄂魯冷特后 3天，再接種強致病力菌株，對照采用未接種鄂魯冷特的組培苗，同時接種強致病力菌株， 7天后，前者發病率為 0，后者發病率為 100%（圖 25），表明免疫抗病接種劑 鄂魯冷特具有很好的免疫抗病效果。 11 圖 20青枯雷爾氏菌轉 GFP無致病力菌株接種 圖 21青枯雷爾氏菌轉 GFP無致病力菌株接種濃度 圖 22青枯雷爾氏菌轉 GFP無致病力菌株接種溫度 圖 23青枯雷爾氏菌轉 GFP無致病力菌株接種方法 圖 24青枯雷爾氏菌轉無致病力菌株免疫接種劑 圖 25青枯雷爾氏菌轉 GFP無致病力菌株接種抗病 5青枯雷爾氏菌無致病力菌株免疫接種劑的生產工藝 對青枯雷爾氏菌轉無致病力菌株的生產工藝進行了研究，提出了菌種制備方法，發酵培養基配方、發酵控制工藝、濃縮提取工藝、基質干燥工藝、產品配置工藝、產品質 量標準、產品保存條件、產品效果檢測方法等，生產出青枯病免疫抗病接種劑 鄂鄂 魯魯 冷冷 特特 （圖 26） 12 圖 26青枯病免疫抗病接種劑 鄂鄂 魯魯 冷冷 特特 生產工藝 6青枯雷爾氏菌無致病力菌株接種免疫抗病特性 用免疫接種劑 鄂魯冷特 100倍液浸種番茄，用清水對照，而后將番茄種子發芽，苗床育苗，田間移栽， 25天后觀察苗期青枯病發病率，處理組發病率低于 3%,對照組發病率高于 38%，說明免疫接種劑 鄂魯冷特對番茄苗期青枯病有較好的控制能力（圖 27）。用免疫接種劑 鄂魯冷特 300倍液對茄子苗進行灌根，用清水對照，處理面積 4畝，在茄子 結果期調查發病率，使用免疫接種劑發病率低于 8%，不使用免疫接種劑發病率高于 47%，防治效果達 83%（圖 28）。 圖 27免疫接種劑 鄂魯冷特對番茄青枯病防效 圖 28免疫接種劑 鄂魯冷特對茄子青枯病防效 7小結與討論 提出了青枯雷爾氏菌脂肪酸型 ,建立了判別模型 ,準確率 93%。 建立了青枯雷爾氏菌分化的細菌色譜鑒定體系 。 設計了 PhcA基因引物 , 鑒別青枯雷爾氏菌強株、弱株、過渡型株 。 完成了青枯雷爾氏菌 GFP基因轉化 。 生產出青枯病免疫接種劑 ,測定了免疫接種條件 ,初步實驗了防病效果 。 后續研究，植物免疫機理 研究，植物非特異性免疫指標測定，包括接種無致病力菌株后植株酶的變化， phcA基因探針， EPS測定等等。無致病力菌株伴生菌的研究，強無致病力菌株體內競爭研究。植物作為無致病力菌株生物反應器的生長條件研究，包括生理小種、寄主、部位、生物期、生長條件等。植物免疫接種劑生產工藝、制劑技術、保存技術、質量標準、使用技術等。 13 （二） 作物枯萎病 原菌 的遺傳分化及其生物防治研究 1 作物枯萎病 原菌 的遺傳分化 枯萎病是由致病性鐮刀菌引起的一種土傳真菌病害，該病在福建省內發病嚴重，在瓜類作物（西瓜、黃瓜、甜瓜等）、香蕉、花生等 作物上均有發生，導致減產 20%～ 30%，嚴重的的田塊可達 50%～80%，甚至絕產。所以枯萎病成為福建省乃至全國作物生產發展的主要限制因子。本研究室從發生枯萎病的植株上采集、分離了一批枯萎病菌，經常規的形態鑒定及分子鑒定，發現它們屬于鐮刀屬的3 個不同小種：尖鐮孢、茄鐮孢和串珠鐮孢。對這 3 個種的 ITS序列分析，結果表明，這 3 個種之間的 ITS序列差異較大，但各個種種內菌株的 ITS序列相同或只有 1 至 2 個堿基的差異。為了分析各個種種內菌株間的遺傳多樣性，我們采用了 RAMS標記， RAMS標記 ]具有微衛星分析的穩定性和 RAPD分析的普遍性，重復性高，正逐漸應用在病原真菌的研究中。 供試的 43株尖鐮孢菌見表 1， 30株串珠鐮孢菌見表 2， 8株茄鐮孢菌見表 3。 從 27個 RAMS引物中篩選 10個擴增條帶清晰、多態性強的引物。 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。 PCR 反應的每個樣的總體積為 25μL。反應體系： 10xPCR Buffer for Taq Plus ， Taq polymerase ， 10mmol/L dNTP ， 引物 (10pmol) ， Template ， Sterilized water 。反應程序為： 94℃ ， 10min，接著 45 個循環，每 1 循環的程序為 94℃ 變性 30s， 57℃復性 45s， 72℃ 延伸 2min，最后 72℃ 延伸 10min。 擴增結束后，取 5μL PCR產物進行 %瓊脂糖凝膠電泳以檢查擴增結果。然后在 Gel Doc 2020 凝膠成像系統（ BioRad）上觀察并貯存圖像。 參照 RAMS擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，每一條 DNA帶均為一個分子標記，并代表一個引物結合位點。根據各分子標記的遷移率及其有無統計所得位點的二源數據：有帶計為“ 1”，無帶 計為“ 0”，強帶和弱帶均計為“ 1”，組成“ 01”數據表。將所得數據輸入 DPS數據處理系統，采用 NeiLi（ Czekanows）聚類距離中的類平均法 UPGMA(unweighted pair group mean average)進行聚類，并自動生成各供試菌株的遺傳聚類圖和相異系數表。為反映 RAMS標記的多態性，統計各引物的多態條帶百分率。 表 1 尖鐮孢菌 菌株 N0 Strain Number Host Strain Location 1 121 黃瓜 漳州 詔安 2 146 不詳 3 283 盆栽苗 4 129 甜瓜 福州永泰 5 130 福州永泰 6 131 福州永泰 7 144 福州義序 8 134 西瓜 福州永泰 9 137 福州 永泰 10 140 福州永泰 11 141 福州永泰 12 219 福州永泰 13 644 FusariumYuxi2 福清漁溪 14 173 瓠瓜 福清 15 147 辣椒 漳州詔安 16 166 福清 17 865 莆田 18 152 豇豆 泉州 19 370 香蕉 漳州 20 387 漳州 21 389 漳州 14 22 391 漳州 23 392 漳州 24 393 漳州 25 820 花生 泉州惠安 26 821 泉州惠安 27 824 泉州惠安 28 831 泉州惠安 29 833 泉州惠安 30 834 泉州惠安 31 836 泉州 惠安 32 841 泉州惠安 33 842 泉州惠安 34 846 泉州惠安 35 847 泉州惠安 36 855 泉州惠安 37 856 泉州惠安 38 857 泉州惠安 39 858 泉州惠安 40 860 泉州惠安 41 861 泉州惠安 42 863 泉州惠安 表 2 串珠鐮孢菌 菌株 N0 Strain Number Host Strain Location 1 120 黃瓜 漳州詔安 2 122 漳州詔安 3 123 漳州詔安 4 124 漳州詔安 5 128 甜瓜 福州永泰 6 132 福州永泰 7 133 西瓜 福州永泰 8 135 福州永泰 9 160 （ 31） 福州永泰 10 163 （ 08） 福州永泰 11 174 瓠瓜 福清 12 165 辣椒 福清 13 709 寧夏 14 829 莆田 15 170 豇豆 福清 16 171 福清 17 380 香蕉 漳州 18 382 漳州 19 383 漳州 20 390 漳州 21 814 花生 FH. 36202006082601 泉州惠安 22 815 FH. 36202006082602 泉州惠安 23 819 泉州惠安 24 822 泉州惠安 25 823 泉州惠安 26 838 泉州惠安 27 840 泉州惠安 28 843 泉州惠安 29 845 泉州惠安 30 859 泉州惠安 表 3 茄鐮孢菌菌株 N0 Strain Number Host Strain Location 15 1 176 番茄 福清 2 177 福清 3 832 花生枯萎病植株 泉州惠安 4 848 花生爛果病莢果上新長出的幼苗 泉州惠安 5 849 泉州惠安 6 850 泉州惠安 7 851 花生爛果病莢果 泉州惠安 8 853 泉州惠安 PCR擴增結果 圖 3分別是部分 RAMS引物對尖鐮孢、串珠鐮孢、茄鐮孢菌的擴增結果，從圖中可看出各樣品的擴增片段大小介于 2003000bp 之間，各菌株的擴增帶型具有一定差異性，說明 RAMS 標記適用于鐮刀菌的遺傳多樣性分析。 圖 1 引物 R24 對尖 鐮孢菌擴增結果 圖 2 引物 R24 對串珠鐮孢菌擴增結果 圖 3 引物 R22（ A）和引物 R24（ B）對茄鐮孢菌擴增結果 聚類分析 尖鐮孢菌的聚類分析 從系統聚類分析所生成的樹狀圖譜（圖 4）可以明顯看出，以 ，供試 42個 尖鐮孢菌 菌株可以聚為 9個類群 ，第 I組群為 黃瓜上一株非致病力菌株（ 121） ；第 II組群 包括：甜瓜上 2個菌株（ 129和 130）、豇 豆上 1個菌株（ 152）、花生上 15個菌株、西瓜上 6個菌株 ；第 III組群 16 為 辣椒作物上分離的 3個菌株 ； 第 Ⅳ 組群 為 1株黃瓜上分離菌株（ 283）和 1株甜瓜上分離的菌株（ 131）；第 Ⅴ 組群 為花生上分離的 3個菌株； 第 Ⅵ 組群 為 1株黃瓜上分菌株（ 146）； 第 Ⅶ 組群 為 6株香蕉上分離的菌株； 第 Ⅷ 組群 為 1株甜瓜上分離的菌株（ 144）； 第 Ⅸ 組群 為 1株瓠瓜上分離的菌株（ 173）。 圖 4 尖鐮孢菌聚類圖 串珠鐮刀菌聚類分析 30 株串珠鐮刀菌的聚類分析如圖 5 所 示，以 的遺傳相異系數為臨界值，供試 30 個串珠鐮孢菌菌株可以聚為 8 個類群，第 I 組群為黃瓜上 4 個菌株和西瓜上 1 個菌株；第 II 組群為辣椒上 2個菌株（ 709 和 829）；第 III 組群為甜瓜上 1 個菌株和瓠瓜上 1 個菌株；第 Ⅳ 組群為西瓜上分離 3個菌株；第 Ⅴ 組群包括： 4 個香蕉上分離菌株（ 38 380、 38 390）、辣椒上 1 個菌株（ 165）、豇豆上 2 個菌株、花生上分離的 1 個菌株；第 Ⅵ 組群為花生上分離的 7 個菌株；第 Ⅶ 組群為花生上分離的 2 個菌株；第 Ⅷ 組群為 1 株甜瓜上分離的菌株（ 132）。 17 圖 5 串珠鐮刀菌聚類分析 圖 6 茄鐮刀菌聚類分析 茄鐮刀菌聚類分析 以 ， 8個茄鐮孢菌 菌株可以聚為 2個類群 ，第 I組群為 辣椒上分離的