免疫學實驗技術(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。 不易吸附 的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法。 親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的 DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。 脂類物質 無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發后，讓脂質自然干固在固相表面。 優點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的 1/10乃至于 /100。 ? 包被條件： 包被液： 、 、 pH78的 TrisHCL緩沖液。 ? 加入包被液后，在 48℃ 冰箱中放置過夜， 37℃ 中保溫 2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為 10ng/ml20ug/ml。 ? 包被緩沖液的選擇要依靠你所包被的物質而定，沒有絕對的選擇，但有一個原則就是要盡可能的保持包被物的活性不被損失。目前常用的包被緩沖液有 PBS、 CBS、 tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液等，一般來說，緩沖液的 pH要大于蛋白質的 pI，以保持其活性。 ? 堿性包被液如碳酸緩沖液用的較多，尤其是在小分子和載體蛋白的偶聯物的包被，其主要的優勢在于堿性環境可以使蛋白更容易與板子結合。也有用 PBS和檸檬酸緩的，但是比較少見。 ? 洗滌： ? ELSIA洗滌：達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。常用的洗滌液為含 % 吐溫 20的磷酸鹽緩沖液，洗滌 3次， 5 min/次。 ? 清除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。 ? 可以說在 ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。 ? 封閉： ? 封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而避免 ELISA后續步驟中抗原或抗體與固相載體的直接吸附。 ? 常用封閉劑： %%的 BSA。 10%的小牛血清或 1%明膠 。脫脂奶粉 ,比較價廉，可以高濃度使用（ 5%）。 ? 所有的 ELISA固相均需封閉。 ? 孵育： ? 抗原抗體完成反應的保溫過程稱為孵育，通常 37℃ 孵育 h。 ? 應注意孵育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。 ? 顯色： ? 于各反應孔加入臨時配制的 TMB底物溶液 ml， 37℃ 反應 1030 min。 ? 顯色是酶催化無色的底物生成有色產物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。 ? 結果測定： ? 于各反應孔加入 2M硫酸 ml，終止反應；拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。于 450 nm處，以空白孔調零后測定各孔 OD值。 ? 結果判定： ? 目測定性法：加入底物經酶解和終止反應后，肉眼觀察陽性孔顏色明顯深于 (競爭法則淺于 )陰性對照；與陰性對照的顏色接近者，判定為陰性。 ? 以 P/N值 (陽性孔 OD值 /陰性孔 OD值 )大于或等于 ； P/N值小于 ，但大于 ； P/N小于 。 對照設定 ? 陽性對照和陰性對照是檢驗試驗有效性的控制品，同時也是作為判斷結果的對照。 ? 陽性對照的基本組成應盡量與檢測標本的組成一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。 ? 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質。 ? 參考標準品：定量測定應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的 45個濃度。 ELISA的應用 ? ELISA應用的范圍很廣，而且正在不斷地擴大，原則上 ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。 ? 檢查抗原和半抗原方面：在內分泌方面已經用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當，在血液學方面可用于檢查凝固因子（如第 Ⅷ 凝固因子）、紅細胞抗原及結合球蛋白（ Hapto Globin）等，在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（ AFP）癌胚抗原（ CEA）。 ? 檢查抗體方面：用 ELISA間接法檢查抗體，已獲得對多種傳染病和寄生蟲病的血清學診斷，亦開始廣泛用于現場流行病學調查。在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學診斷；在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測定以及對過敏的診斷，例如檢測各種過敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等；在衛生學方面，可用于檢測食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。 免疫印跡（ western blot） 印跡法（ blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法 。 1975年， Southern建立了將 DNA轉移到硝酸纖維素膜（ NC膜）上，并利用 DNA－ DNA雜交檢測特定的 DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。 而后人們用類似的方法，對 RNA和蛋白質進行印跡分析，對 RNA的印跡分析稱為 Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為 Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。 埃德溫 邁勒 薩瑟恩 （ Edwin Mellor Southern） 基本原理 應用范圍 ? 檢測組織、細胞中蛋白的表達情況（定性、半定量） 底物溶液，當二抗上的酶催化底物產生化學發光時 ,用 X光片曝光，洗片后就會產生可見的區帶，指示目的蛋白質的位置和強弱。 品分開。 （如 5％的脫脂奶粉）處理以封閉固相載體上剩余的疏水結合位點，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印跡中只有目的蛋白質與一抗特異性結合。洗去游離的一抗后，用再與酶標記的二抗孵育 白從凝膠轉移至一種固相支持體 .轉移后的硝酸纖維素膜就稱為一個印跡（ blot），用于對蛋白質的進一步檢測。 或組織蛋白，測定總蛋白濃度 度，并處理樣品 基本步驟 細胞總蛋白的提取 ? 提取細胞蛋白多是利用將細胞裂解、破碎、使蛋白質釋放的原理。提取蛋白質的方法很多， 鑒于后續實驗對蛋白性質的要求不同，因此很難找到一種萬能的裂解方法。 ? 不論采用那種方法，都應遵循以下原則： 1．盡可能采用簡單方法進行樣品處理，以避免蛋白丟失。 2．細胞和組織樣品的制備應盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解，蛋白酶抑制劑的種類很多，要根據具體情況具體選擇。本實驗中選用 PMSF(苯甲基磺酰氟 )作為蛋白酶抑制劑。 3．樣品裂解液應