基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目資金申請報告(已成功申請國家補助資金)(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 飲料總產量保持持續增長， 1980年不足 30萬噸， 1990年猛增到330 萬噸，到 2021 年為 1491 萬噸， 20年增長 50 多倍，平均年增長速度為 %，進入 2021 年達到 1669 萬噸，比 2021 增長%，繼續保持兩位數的增長速度，是食品工業發展最快的行業之一。 依照國際慣例， 稱之為果汁 型 飲料 的飲品 ，其果糖含量必須在 %以上 ，目前國內以“農夫果園”、“健力寶”為代表 的大型飲料生產企業，均開始在飲料中添加果葡糖漿。 近幾年國內飲料實際產量及預測 表 1— 7 80年 90年 2021年 2021年 2021年 2021年 2021年預計 軟飲料產量 30 330 1491 1669 2425 2788 3688 其中 :含糖飲料 1000 1215 1397 1847 基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 20 由以上數據 及分析 可以看出，由于國內果葡糖漿市場的迅猛成長，帶動葡萄糖異構酶的銷量年年攀升，目前國內葡萄糖異構酶的年消耗量約在 300噸左右，并以每年 10%的速度遞增，預計到本項目建成投產時，市場年需 求量將超過 400 噸。 六、市場開發情況 目前安徽 *****生物技術有限公司已與蚌埠明星果糖有限責任公司（原蚌埠果糖廠）、安徽豐原集團有限公司等企業進行了良好的溝通及合作，并初步達成基因重組葡萄糖異構酶的購買及使用意向（附件 45）。 同時，世界上最大的果葡糖漿生產廠家美國嘉吉（ Gargill）公司也對 **公司的 基因重組葡萄糖異構酶 產品 產生濃厚的興趣，近期正與 **公司接洽，希望成為其合作伙伴及該產品在美國的銷售總代理。 七、結論 由以上分析可見，基因重組葡萄糖異構酶項目具有十分廣闊的市場前景。本 項目建成投產后，可年產葡萄糖異構酶 300噸，基本可滿足國內市場的需求量，待產品市場逐步打開后，完全有能力 覆蓋亞洲周邊市場并 出口 歐美 市場。 基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 21 第二章 項目的技術基礎 固定化葡萄糖異構酶是生產果葡糖漿的生物催化劑。葡萄糖異構酶（ GI）又稱木糖異構酶（ XyI）（ EC ），能將 D木糖、 D葡萄糖、 D核糖等醛糖轉化為相應的酮糖。因葡萄糖異構酶結構穩定，是國際上公認的研究酶的催化機制及建立蛋白質工程技術的最好模型之一。工業上，葡萄糖異構酶是大規模從淀粉制備果葡糖漿的關鍵酶。隨著我國食品工業的迅速發 展，果葡糖漿在國內的市場增長迅猛，對葡萄糖異構酶的需求也 在 不斷增加。由于其重要的經濟價值和理論研究意義，美國、日本、英國、法國、比利時、荷蘭等發達國家對該酶的性質、固定化工藝、基因工程、晶體學以及蛋白質工程等進行了廣泛深入的研究。 本項目主要技術原理為：利用基因工程技術改造已獲得的 7號淀粉酶鏈霉菌 M1033的葡萄糖異構酶結構基因，通過基因突變的方法改變葡萄糖異構酶的熱穩定性，采取基因敲除和基因置換的方法對 7號淀粉酶鏈霉菌 M1033的染色體進行改造引入優勢突變位點，獲得性能改良 、 穩定遺傳的適于工業化生產的基因 工程菌株 ，從而 應用于葡萄糖異構酶的大規模生產。 國內自六十年代起已開展了葡萄糖異構酶應用于果葡糖漿生產的研究，山東省食品發酵工業研究設計院通過誘變篩選獲得的 7號淀粉酶鏈霉菌 M1033菌株，是國內在這方面最具應用價值基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 22 的工業菌之一。目前國內 外 主要是通過誘變篩選等手段來獲得生產用菌株，中國科學技術大學生命科學學院是國內唯一開展葡萄糖異構酶的蛋白質工程的研究單位， 并 對葡萄糖異構酶的催化機理及其蛋白質工程進行了多年的研究和探索。經十余年科技攻關目前已完成葡萄糖異構酶的蛋白質工程改造，獲得性質改良的基因重組葡萄糖異構酶 ；并利用基因工程方法構建表達量極高的基因重組鏈霉菌工業生產菌株，獲得了具有完整自主知識產權的同源重組基因工程菌 M1033WZ。所建立的葡萄糖異構酶蛋白質工程研究系統在完整性和有效性上都達到國際先進水平，在國內處于領先水平 。 在該課題的研究過程中， 項目 組在國內外知名刊物發表學術論文十余篇（附件 415， 416），并獲得安徽省高等學校科學技術進步獎及安徽省優秀論文獎（附件 417）。 第一節 成果來源 及 知識產權 情況 中國科學技術大學生命科學學院獨立承擔國家“八六三”項目“葡萄糖異構酶的蛋白質工程”（附 件 414），歷經十余年聯合科技攻關目 ， 前已完成葡萄糖異構酶的蛋白質工程改造，獲得性質改良的基因重組葡萄糖異構酶；并利用基因工程方法構建高表達量的基因重組鏈霉菌工業生產菌株，獲得了具有自主知識產基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 23 權的同源重組基因工程菌 M1033WZ。 中國科學技術大學根據學校知識產權管理規定，經慎重研究，決定將基因重組葡萄糖異構酶技術所有權作價 175 萬元人民幣作為學校投資投入中 國科學技術大學 科技實業總公司。（見附件 411） 2021年 2月 28日， 中國科學技術大學 科技實業總公司以合資成立安徽 *****生物技術有限公司補充協議的 形式，將基因重組葡萄糖異構酶技術以 177萬元人民幣的價格向合資公司轉讓，其中 50 萬元按國家及學校有關政策獎勵給相關技術團隊成員。轉讓后，基因重組葡萄糖異構酶技術的所有權歸安徽 *****生物技術有限公司所有。（見附件 41附件 413） 第二節 已完成研究開發工作及鑒定、中試情況 一、背景資料 葡萄糖異構酶（ Glucose Isomerase，簡稱 GI）結構穩定，是國際上公認的研究酶的催化機制及建立蛋白質工程技術的最好模型之一。利用基因工程和蛋白質工程的方法改造野生型葡萄糖異構酶不僅具有理論研究意義 而且具有重要的經濟價值，在異構化反應中，溫度提高，熱力學平衡趨向于果糖方面，因此提高野生型葡萄糖異構酶的熱穩定性可以增加反應平衡過程中果糖的產量，從而降低投入酶量，簡化工藝流程，提高經濟效益。 基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 24 基因的同源重組技術（ homologous rebination），又稱基因打靶（ gene targeting），指外源 DNA與受體細胞染色體 DNA上的同源序列之間發生重組并整合在預定位點上，從而改變細胞遺傳特性的方法。根據重組后靶基因的特征可以分為兩種類型：由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有結構被破壞 ，此即為基因破壞或剔除（ gene disruption or knockout）； 靶基因的全部序列為新的基因所取代 ，即基因置換 （ gene replacement）。這一新興技術已被證明為目前能精確的修飾基因組的最有效方法，從理論上講它將使人類能按設計對極其復雜的細胞基因組結構進行定點、定量的改變，從而定向的改變細胞的遺傳結構和特征。 本項目在國內首次將基因重組技術應用于葡萄糖異構酶的研究和生產，其技術特性及所建立的葡萄糖異構酶蛋白質工程研究系統均達到國際先進水平，所獲得的基因重組葡萄糖異構酶適用于果葡糖 漿的大規模生產，將從根本上改變我國葡萄糖異構酶生產的 落后 狀態。 二、成果的專利情況 目前項目共獲得 3 項國家發明專利： “ SM33GI 的突變酶GIG138P 及一種提高 GI 熱穩定性的突變方案 ”（專利號）、“一種葡萄糖異構酶的 247位單突變體酶和 138，247 位雙突變體酶及其構建方法”（專利號 ） 、“表基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 25 達 M1033GI的突變酶 GIG138P的基因工程菌株 M1033WZ及其構建方法” (專利號： )，其中“表達 M1033GI的突變酶GIG138P的基 因工程菌株 M1033WZ及其構建方法”已獲得 PCT國際專利受理。（見附件 4 4 4 4 4 411） 三、成果鑒定及中試情況 該項技術在 2021 年 3 月安徽省科技廳組織召開專項科學技術成果鑒定會上通過專家評審，認為“該課題采用的技術方法先進，技術路線正確，研究成果達到國內領先水平。建議盡快實現產業化。”，同時獲得安徽省科技廳頒發的科學技術成果鑒定證書（ 2021年第 030號）以及高新技術成果認定證書（ 2021001號）。（見附件 4 43） 2021 年 10 月 28 日至 12 月 28 日， 中國科學技術大學生命科學學院委托蚌埠明星果糖有限責任公司（原蚌埠果糖廠）進行固定化葡萄糖異構酶大柱轉化實驗。經實驗，在 68℃轉化溫度及 pH 值 ，單柱一次投入成品固定化葡萄糖異構酶 93公斤（含水 %），經過 60 天轉化共計生產出成品果葡糖漿，平均轉化能力為 /公斤酶，轉化率為 52%。產品的各項性能指標在國內屬先進水平，可以用于果葡糖漿的大規模生產。（見附件 44） 基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 26 四、產品技術指標及與國內外同類產品比較 產品技術、質量指標 本項目產品將在滿足中華人民共和國國 家標準《食品添加劑固定化葡萄糖異構酶制劑 》（ GB 827487）的基礎上，全面提高葡萄糖異構酶各項性能指標，并逐步形成企業標準。 產品的主要性能指標 序號 項 目 理化指標 1 酶活力（ 60目） 6000 單位 2 形狀 不規則桿狀，直徑 3 色澤 棕色 4 含水 1218% 5 比重 6 膨脹率 倍 7 轉化能力 噸成品糖漿 /公斤成品酶 8 保存性 05℃下保藏 3個月，酶活損失 10%左右 9 最適 pH 10 熱穩定 性 最適反應溫度 68℃ 11 金屬離子影響 Cu2+、 Fe2+、 Ca2+對酶活力發揮不力； Mg2+、Co2+可促進轉化 基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 27 與國內、外同類產品技術指標比較 本項目產品系國內首創，填補國內空白，國內目前無同類產品。現將該成果技術參數與丹麥諾維信公司的同類產品Sweetzyme174。IT 進行比較如下： 序號 指標名稱 單位 Sweetzyme174。IT 基因重組葡萄糖異構酶 1 活力 UGI 3500 6000 2 熱穩定性 ℃ 5560 最適反應溫度 68℃ 3 PH 4 轉 化能力 噸成品糖漿 /公斤酶 5 第三節 成果的創新之處 本項目是國家“ 863”計劃項目“葡萄糖異構酶的蛋白質工程”的重要成果之一，解決了提高葡萄糖異構酶的熱穩定性和酶活力的難題，并為基因重組葡萄糖異構酶的產業化生產打下堅實基礎，擁有多項我國自主的知識產權，創新性強，技術水平高，難度大，許多成果在國際上居于領先地位。根據查新報告（見附件 41），本項目的主要創新點和技術難點如下： 雙突變體酶 GI（ G138PG247D）的構建技術 雙突變體酶的構建，使困擾葡萄糖異構酶研究和生產領域 多年的野生型菌株所產的葡萄糖異構酶熱穩定性和酶活力難以充基因重組葡萄糖異構酶工程產業化項目 資金申請報告 28 分滿足需要的難題得以解決，為利用基因工程技術改造葡萄糖異構酶創造了條件。這一成就在國際上處于領先地位，并已申報國家發明專利。 利用基因敲除和置換精確修飾鏈霉菌染色體技術 本項目利用同源重組技術，把帶有篩選基因的質粒片斷的堿變性形式作為同源重組單元引入野生型 M1033染色體 DNA的特定片段上，敲除了原有的 GI 基因。再通過雙抗性負篩選的方法，引入目的基因，并隨染色體 DNA 的復制而穩定復制。 雙抗性負篩選（ tsr + neo）方法的運用 首先構建帶有 neo抗性的置換型同源重組質粒，通過 neo抗性的負篩選來解決鏈霉菌基因置換時篩選工作量大的問題。由于同源片斷較小，同時又為了保證較高的轉化率，直接將同源重組質粒的堿變性形式作為同