生物化學課件之一武漢大學張楚富-資料下載頁

　　

【正文】 逐漸變小，彼此之間相互凝聚而發生沉淀，此現象稱作 鹽析 (sattingout) 。 離子強度 (μ) ＝ ΣCZn21/2 三、 蛋白質的沉降作用及超離心分離 沉降速度 (ν = dx / dt )與蛋白質分子的大小和密度有關。 沉降速度法 ，適用于分離沉降系數不同但密度相近的蛋白質。 沉降平衡法 ，適用于沉降系數相近，但密度不同的蛋白質。 沉降系數： 當沉降界面以恒定的速度移動時，單位離心場里的沉降速度。 四. 凝膠過濾 是指利用高度水化的，具有不同大小孔徑的網狀結構的惰性多聚物顆粒作為層析柱的填充物，把分子大小不同的蛋白質混合物上樣到柱層析上，混合物中的各組分隨著洗脫液的流動，按分子大小以不同的速度向下移動，從而把各組分分開 （圖 249） 。 常用的有葡聚糖凝膠 (sephadex,)或瓊脂糖凝膠(sepharose) 作為層析柱的填充物 。 五、蛋白質的配體特異性與親和層析 根據蛋白質的配體特異性，建立了一種非常有效的蛋白質分離方法 ——親和層析法 。假如某蛋白質 A，在表現功能的過程中需要和 B物質結合，且結合是特異的： A + B＝ AB 假若用化學的方法先將 B物質與一種不溶性載體 (R) 偶聯，得到 RB，偶聯到 R上的 B不喪失與 A結合的能力的話，那麼，將含有 A的混合蛋白通過裝有 RB的層析柱時， A將與 B結合 , 形成 R－ BA，不能與 B結合的雜蛋白將從柱下流出 , 然后用適當的洗脫液將 A洗脫下來。 練習題 1. 某種蛋白質當用凝膠過濾法測定其分子量為 90kD，而用SDSPAGE測定其分子量為 60kD，無論是否有巰基乙醇存在都如此。為什么會有二種不同的結果？你認為哪種方法更準確？ 2. 從下面的信息確定某一蛋白質亞基組成： 1). 用凝膠過濾法，測定其分子量為 200kD， 2). 用 SDSPAGE，測定其分子量為 100kD， 3). 在巰基乙醇存在下，用 SDSPAGE分析，獲得的分子量 為 60kD和 40kD. 3. 1). 是 Trp還是 Gln更有可能出現在蛋白質的表面？ 2). 是 Ser還是 Val更少可能出現在蛋白質的內部？ 3). 是 Leu還是 Ile更少可能在 αLelix的中間部位找到？ 4). 是 Cys還是 Ser更有可能出現在 βSheet中？ 4. 在生理條件下，多聚賴氨酸呈隨機卷曲的構象，在什么樣 的條件下，它可以形成 αhelix？ Chapter 3. 酶 (Enzyme) Section 1 酶 的 基 本 性 質 一、酶是生物催化劑 酶是生物細胞產生的、以蛋白質為主要成分的、能加快化學反應速度、使之迅速達到平衡、但不改變反應的平衡常數的生物催化劑。酶的催化活性受多種因素調節控制。 二、酶能快細胞內的化學反應速度 按照能量學的觀點 ,一個化學反應并不是從反應物直接向產物生成的方向進行的。 反應的發生 ,即產物的生成取決于過渡態或轉換態 (transition state)的能量狀況 。只有當反應物在空間定向上有利于反應以及反應物達到轉換態所需的能量（即是否處在化學鍵的斷裂或形成所需的范圍內）時，反應才能發生。 很顯然 , 轉換態越能有效的達到，反應的速度就越大。 如 圖 3—1所示 ,反應物從基態轉變成轉換態的能量差值稱為活化能 (△ G?)。 毫無例外 , 每一種化學反應都有一個 △ G?。 根據轉換態的理論，一種催化劑的作用在于以某種途徑降低反應的活化能而增高化學反應速度。 因此，在有催化劑存在的情況下，轉換態能比較有效地達到，從而增高反應的速度。典型的酶促反應速度比無催化劑存在的反應要高出 106～ 1012倍。 三、酶不能改變化學反應的平衡 反應速度和反應平衡之間有著重要的差別。 催化劑的功能是增高反應的速度，而不會改變反應的平衡。酶的存在，象其他催化劑一樣，只能降低達到轉換態所需的活化能而不能改變反應的平衡，它唯一的作用是加速反應物和產物的相互轉化。在反應中，酶不會被消耗，平衡點不會改變，但達到平衡的速度則要快得多。 反應的平衡與△ G0′ （產物與反應物所固有的標準自由能之差）有著密切的關系，但反應速度則與△ G?有關。 四、酶的催化反應具有專一性 酶對所催化的底物具有不同程度的選擇性。 某一種酶往往只能對某一類物質起作用，或者只對某一種物質起催化作用。一般無機催化劑對它們所作用的底物沒有這種嚴格的選擇性。 五 、 酶的組成 1．酶的組成 ● 由單純蛋白質所構成的酶 ● 由蛋白質和其他成分構成的酶 :除了蛋白質成分 (即 酶蛋白apoenzyme)外，還含有一些對熱穩定的非蛋白質小分子物質 (即 輔助因子 cofactor)。 輔助因子 分 輔酶和輔基 (coenzyme amp。 prosthetic group)， 它們是這類酶的催化活性的必要條件，缺少它們，酶的催化作用就會消失。 、結合部位和催化部位 酶的活性中心通常是指酶分子上直接與底物結合并與催化作用直接有關的部位，是由酶分子上的某些氨基酸殘基的側鏈基團共同構成。 酶的 活性中心可分兩部分： 參與和底物結合的 結合部位 (binding site) 及直接參與催化反應的 催化部位 (catalytic site) 。 兩者對酶活性都是必須的，前者決定酶的專一性，后者決定酶的催化能力。 六、某些 RNA具有催化活性 長期以來 ,人們都認為所有的酶都是蛋白質 .但是近 20年來，越來越多的例子表明某些 RNA分子也是生物催化劑。這些 具有催化活性的 RNA，叫做 Ribozyme，意即酶活性 RNA。 例如 ,RNase P是一種與 tRNA前體加工成 tRNA反應有關的酶。， 在體外， 單獨的蛋白質組分不能催化 tRNA前體轉變成 tRNA，而 RNA組分在適當的條件下能完成這種轉變反應。另外一個例子是 四膜蟲 26S rRNA前體中的插入順序的切除與兩端片段的正確拼接不需要蛋白質的催化，是一種自我剪接的過程。該過程需要鳥苷或者鳥苷酸的存在 .在體內，這種剪接方式可能只進行一次， 但在體外， 他象一種真正的酶一樣能作用多次。 ,肽鍵的形成很可能是 50S核糖體亞基催化的。催化這一反應的酶叫做肽基轉移酶。當把所有的蛋白質組分從 50S核糖體亞基中去除后， 23S rRNA能催化這一肽鍵的形成反應 (圖 3— 2). 七、催化抗體 抗體酶 抗體是免疫球蛋白。催化抗體 (catalytic antibodies)又叫做抗體酶 (abzymes)。象其它抗體一樣 , 抗體酶也是一種生物對叫做抗原 (antigen)的某種外源分子作出應答的產物 , 只是這種抗原分子被有目的地改造成某種反應的轉換態中間物。 推理是： 一種能專一同某反應的轉換態中間物結合的蛋白質，必定能啟動正常反應物進入到活潑的轉換態構象。因此 , 一種催化抗體便能促使它的底物形成轉換態構象，從而加速這一反應。常規酶最顯著的催化效力是因為它們對所催化的反應轉換態中間物有很高的親和力，因而抗體酶同它的專一性底物（抗原）必定有很高親和力。 Section 2. 酶的命名與分類 一 . 命名原則 例如：乙醇脫氫酶 1).應標明酶的所有底物及催化的性質，并用 : 符號把底物分開。例如：乙醇： NAD+脫氫酶 . 2).不管催化正反應還是逆反應，一般都用同一名稱。 3).如果所催化的反應包含二種變化，則盡可能用同一種變化 來表示 ,另一個功能附后。 例如： L谷氨脫氫酶催化的反應是： （圖 33） 谷氨酸： NAD+脫氫酶 (脫氨 )。 二 .酶的分類 (圖 33) : 催化氧化還原反應： A2H + B → A + B 可分為 需氧脫氫酶、氧化酶 和 不需氧脫氫酶 。 (transferanses)： 催化功能基團的轉移反應： AB + C ←→A + BC (hydrolases): 催化水解反應 :AB + HOH →AOH + BH (lyases)： 催化底物裂解反應，并產生雙鍵，或其 逆反應，將一個基團加到雙鍵上： AB ←→ A + B 例如： （圖 34） (isomerases)：催化各種同分異構體的相互轉變： A ←→ B 如異構酶和消旋酶催化的反應。 (連接酶 )類 (ligases)： 這類酶催化一切必須與 ATP分解相聯，并由二種物質合成一種物質的反應： A + B + ATP → A B + ADP + Pi(或 AMP + PPi) 例如谷氨酰胺合成酶催化的反應： （圖 33） Section 3 酶反應動力學 一、酶活力與酶的反應速度 要檢查酶的存在及含量 , 不能直接用重量或體積來表示 , 要根據酶引起的某一特定的化學反應的能力來表示 , 即用酶的活力來表示 . 酶活力的高低是研究酶的特性、進行酶制劑的生產及應用時的一項不可缺少的指標 .酶活力又叫酶活性 (activity)是指酶催化一定化學反應的能力 . 酶反應速度可以用單位時間內、單位體積中底物的減少量或產物的生成量表示 , 即用 : d[s]/d[t] 或 d[p]/d[t] 表示 . 研究酶反應速度或測定酶的活性應以酶促反應的初速度(initial rate)為準 .初速度是指在酶濃度底物濃度一定的條件下 , 在最初一段時間內 , 產物的濃度隨時間的增加而成比例的增加時的速度 （圖 36） 。 2. 酶的活力單位 . 國際酶學委員會規定 , 一個酶活力單位 (unit,u) 是指在 25℃下 , 其它條件如 pH及底物濃度均采用最適條件 , 在 1分鐘內轉化1μ mol底物的酶量 (或轉化 1μ mol底物的有關基團的酶量 ).但是，酶的活力單位常根據實際需要來規定。 酶的比活力 (specific activity) 比活力 是指每 mg蛋白質所具有的活力單位數 , 即 活力單位數/mg蛋白質 . 在酶的純化過程中 , 每步純化后都要測定酶的比活力 , 比活力高 , 表明酶的純度高。 酶的純度是用比活力表示的 ： 比活力 = 活力單位數 /mg蛋白 = 總活力單位數 /總 mg蛋白 . 例如 , 某酶經過四個純化步驟后 , 獲得如下的數據 : 純化步驟： Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 總活力： 6 4 3 2 總蛋白： 20 10 5 2 比活力： 6/20 4/10 3/5 2/2 在提純中，總活性在減少，總蛋白也在減少，但比活性在提高。 此外 , 在酶的純化工作中還要計算兩個具有實際意義的項目 , 即 純化倍數和回收率 (產量 %)： 純化倍數 = 每次比活力 /第一次比活力 回收率 （產量 %） =(每次的總活力 /第一次總活力 ) 100 二 、酶反應的基本動力學 酶動力學研究的是酶催化反應的速度，描述酶作為催化劑的生物學作用 , 描述酶是怎樣完成它們所催化的反應。由于酶的最基本特性就是加快生物化學反應速度，因此，所有酶的催化反應速度以及它們的催化效率都是可以定量的。這就是酶促反應動力學研究的基本內容。 1. 底物濃度對酶促反應速度的影響 . 底物濃度對酶促反應速度的影響如 圖 37所示。 1) 中間產物學說 酶動力學研究始于 1902年，當時， β 呋喃果糖糖苷酶對蔗糖進行水解。他發現當蔗糖的濃度比酶的濃度高許多時，反應速度不再取決于蔗糖的濃度，即是說，反應速度相對于蔗糖來說是零級反應。因此，他提出，蔗糖水解的總反應是由兩個基本反應構成， 第一步是底物與酶形成一種復合物，第二步是這種中間物生成產物并釋放出酶 : k1 k2 E + S ←→ ES → P + E k1 這里 ,E、 S、 ES和 P分別代表酶、底、酶 底物復合物和產物。 中間產物學說認為 , 當酶催化某個反應時 , 酶和底物先結合形成一個中間復合物 , 然后中間復合物再分解 , 生成產物并釋放出酶。一般以產物的生成速度代表整個酶催化反應速度，而產物的生成取決于中間物的濃度 . 因此 , 整個酶促反應的速度取決于中間