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2026-03-29 03:16本頁面

　　

【正文】而不影響PCR反應的進行.8,引物的539。端可以修飾,如附加限制酶位點,引入突變位點,用生物素,熒光物質,地高辛標記,加入其它短序列包括起始密碼子,終止密碼子等.(十八),PCR的反應條件答:1,PCR反應的緩沖液:Tris HCl緩沖液KCl 促進引物的退火,濃度太高時會抑制Taq DNA聚合酶活性.加入BSA或明膠有利于保護TaqDNA聚合酶活性.必要時加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級結構,提高PCR反應特異性.2,鎂離子濃度 mmol/L,Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+.Mg 2+濃度過低,會顯 2+ 2+濃度還會影響引物的退火,模板與PCR產物的解鏈溫度,從而影響擴增片段的產率.3,底物濃度工作濃度20200umol/L, dNTPs濃度過高可加快反應速度,也增加堿基的錯配率和實,4種dNTP必須以等摩爾濃度配制,以減少PCR反應的錯配誤差并提高使用效率.4,Taq DNA聚合酶 7580℃時具有最高的聚合酶活性,150個核苷酸/秒。具有良好的熱穩定性,95℃仍有活性,5,引物 ,生成引物二聚體,使目的DNA,引物Tm值在5580 ℃ 范圍較為理想.6,反應溫度和循環次數(十九),影響大腸桿菌系統外源基因表達的因素答:1,啟動子的強弱。2,基因的劑量。3,影響RNA轉錄和翻譯效率的因素:SD序列,mRNA。4,外源基因密碼子的選擇。5,表達產物的大小。6,表達產物的穩定性.(二十),大腸桿菌系統表達外源基因必須具備的條件答:1,要求外源基因的編碼區不能含有內含子。2,表達的外源片段要位于大腸桿菌啟動子的下游,并形成正確的閱讀框架。3,轉錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3,末端相匹配的SD序列,才能被有效的翻譯成蛋白質.4,蛋白產物必須穩定,不易被細胞內蛋白酶快速降解,且對宿主無害.(二十一),真核細胞表達外源基因的條件答:1,中表達外源基因的真核轉錄調控元件。2,注意選擇轉染的受體細胞,不同類型的細胞具有不同的特性。3,注意選擇適當的選擇標記.(二十二),轉基因動物的概念,原理及應用答:1,概念:是指用人工方法將外源基因導入或整合到基因組內,特點是分子及細胞水平操作,組織及動物整體水平表達.2,基本原理:將目的基因或基因組片段用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細胞中,使目的基因整合到基因組中,然后將此受精卵或著床前的胚胎細胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中,使其發育成攜帶有外源基因的轉基因動物,人們可以通過分析轉基因和動物表型的關系,揭示外源基因的功能。也可以通過轉入外源基因培育優良的動物品種.3,應用:建立用于研究外源基因表達調控體系。建立醫學中常用的疾病模型。培育動物新品種。藥理學和藥用蛋白的生產研究.(二十三),基因敲除的基本程序答:通過DNA同源重組,使得胚胎干細胞特定的內源基因被破壞而造成功能喪失,然后通過胚胎干細胞介導得到該基因喪失的小鼠模型的過程稱為基因敲除.1, 打靶載體的構建:同源序列要足夠長,要含有篩選用的標志基因.2, 胚胎干細胞的體外培養3, 打靶載體導入胚胎干細胞4, 同源重組胚胎干細胞的篩選5, 基因敲除胚胎干細胞注射入胚泡6, 胚泡植入假孕小鼠的子宮中7, 雜交育種獲得純合的基因敲除動物(二十四),DNA芯片的原理答:DNA芯片技術就是一種大規模的集成的固相核酸分子雜交,以大量已知堿基序列的寡核苷酸片段為探針,檢測樣品中哪些核酸序列與其互補,然后通過定性定量分析得出待測樣品的基因序列及,樣品的準備,分子雜交和檢測分子.(二十五),誘變劑的作用機制答:1,堿基的類似物誘發突變2,改變DNA的化學結構3,結合到DNA分子上誘發移碼突變4,紫外線及其他射線引起的DNA分子的變化(二十六),突變類型及其遺傳效應答:1,突變類型:① 點突變:.② 缺失:一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失.③ 插入:一個原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈插入到DNA大分子中間.④ 倒位:DNA鏈內重組,使其中一段方向倒置.2,突變的遺傳效應:①遺傳密碼的改變:錯義突變,無義突變,同義突變,移碼突變② 對mRNA剪接的影響:一是使原來的剪接位點消失。二是產生新的剪接位點.③ 蛋白質肽鏈中的片段缺失:(二十七),基因治療的策略答:1,基因置換或稱基因矯正:特定的目的基因導入特定的細胞,通過定位重組,讓導入的正常基因置換基因組內原有的缺陷基因,不涉及基因組的任何改變.2,基因添加或稱基因增補:通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因.3,基因干預:采用特定的方式抑制某個基因的表達,或者通過破壞某個基因而使之不能表達,以達到治療疾病的目的.4, 基因標記:基因標記實驗是基因治療的前奏,并不在于直接治療疾病而是期望能夠提供有關正常細胞生物學和疾病病理方面的信息.(二十八),基因診斷常用的生物學技術.(二十九),簡述重組DNA技術的過程.11 / 11

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