生物化學蛋白質ppt課件-資料下載頁

　　

【正文】 變性后的蛋白質在結構上雖有改變，但組成成分和相對分子質量不變。 E、蛋白質的復性 定義： 如果引起變性的因素 比較溫和 ，蛋白質構象僅僅是有些松散時，當除去變性因素后，可根據熱力學原理緩慢地重新自發折疊恢復原來的構象，這種現象稱作復性 。 核糖核酸酶變性與復性作用 天然狀態，有催化活性 非折疊狀態，無活性 8 M 尿素 ?巰基乙醇 變性 天然狀態 –SS鍵恢復 而且是正確配對 如：－ NH3＋ 、－ COO－ 、－ OH、 SH、 CONH等，它們都具有高度的親水性，當與水接確時，極易吸附水分子，使蛋白質顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。 (四 )蛋白質膠體性質 由于蛋白質分子量很大，在水溶液中形成直徑 1100nm之間的顆粒，已達到膠體顆粒范圍的大小，因而具有膠體溶液的通性。 蛋白質的水溶液能形成穩定的親水膠體的原因： １、蛋白質多肽鏈上含有許多極性基團。 蛋白質是兩性電解質，在非等電狀態時，相同蛋白質顆粒帶有同性電荷， 與周圍的反離子構成穩定的 雙電層 。 使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白質溶液由于具有 水化層 與 雙電層 兩方面的穩定因素，所以作為膠體系統是相對穩定的。 參見 p54 蛋白質膠體性質的應用 由于膠體溶液中的蛋白質不能通過 半透膜 ，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。 透析法： 以半透膜提純蛋白質的方法叫透析法 半透膜： 只允許溶劑小分子通過，而溶質大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等 (五 )蛋白質的沉淀 蛋白質在溶液中的穩定性是有條件的 、相對的 。 如果加入適當的試劑使蛋白質分子處于 等電點狀態 或 失去水化層 （ 消除相同電荷 ， 除去水膜 ） ， 蛋白質膠體溶液就不再穩定并將產生沉淀 。 定義： 蛋白質在溶液中靠水膜和電荷保持其穩定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質溶液的穩定性就被破壞，蛋白質就會從溶液中沉淀下來，此現象即為 蛋白質的沉淀作用。 參見 p54 1 可逆沉淀 ?定義： 在 溫和條件下 ，通過改變溶液的pH或電荷 狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。 ? 在沉淀過程中， 結構和性質都沒有發生變化 ，在適當的條件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為 非變性沉淀。 ? 可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如 等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法 等。 (1)鹽析 在蛋白質的水溶液中，加入大量 高濃度 的強電解質鹽 如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質沉淀析出，這種現象稱為 鹽析 。 而 低濃度 的鹽溶液加入蛋白質溶液中，會導致蛋白質的溶解度增加，該現象稱為 鹽溶 。 鹽析的機理 ： 破壞蛋白質的水化膜，中和表面的凈電荷 。 鹽析法是最常用的蛋白質沉淀方法，該方法不會使蛋白質產生變性 。 各種蛋白質的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質所需中性鹽濃度也有不同，只要調節中性鹽濃度，就可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分散沉淀析出，這種方法稱為 分段鹽析 。 (2)弱酸或弱堿沉淀法 (等電點沉淀） 用弱酸或弱堿調節蛋白質溶液的 pH處于等電點處 ， 使蛋白質沉淀。 弱酸或弱堿沉淀法機理 ： 破壞蛋白質表面凈電荷 。 酸 酸 堿 堿 堿 酸 溶液中蛋白質的聚沉 (3) 有機溶劑沉淀法 ： 在蛋白質溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質產生沉淀。 有機溶劑沉淀法的機理 ： 破壞蛋白質的水化膜 。 注意： 有機溶液沉淀蛋白質通常在 低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產生的溶解熱會使蛋白質產生變性。 2 不可逆沉淀 ?定義： 在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩定性，而且也 破壞了蛋白質的結構和性質 ，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。 ?由于沉淀過程發生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為 變性沉淀。 ?如 加熱沉淀 （次級鍵） 、強酸堿沉淀 （影響電荷） 、重金屬鹽沉淀（ Hg2+、 Pb2+ 、 Cu2+、 Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀 等都屬于不可逆沉淀。 (1)重金屬鹽沉淀 (條件： pH 稍大于 pI為宜 ) 當 pH 稍大于 pI時， 蛋白質顆粒帶負電荷這樣就容易與重金屬離子結合成不溶性鹽而 沉淀。 重金屬沉淀法的機理 ： 重金屬鹽加入之后，與帶負電的羧基結合 。 (2)生物堿試劑沉淀法 （條件： pH稍小于 pI） 生物堿 是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮 的堿性物質。 能夠沉淀生物堿的試劑稱為 生物堿試劑 。 生物堿試劑一般為 弱酸性物質 ，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物堿試劑沉淀蛋白質的機理 ： 在酸性條件下，蛋白質帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結合而產生沉淀 。 例如： “ 柿石癥 ” (3)加熱變性沉淀法 幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固 。 少量鹽促進蛋白質加熱凝固 。 當蛋白質處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速 . 如： 煮雞蛋 (六 ) 蛋白質的顏色反應 (自學 ) 雙縮脲反應 酚試劑反應 蛋白質定量 、 定性 茚三酮反應 測定常用方法 另外還有： 蛋白黃色反應、米倫氏反應、乙醛酸反應 等。 參見 p55 雙縮尿在堿性溶液中能與硫酸銅發生反應，產生紅紫色絡合物，此反應稱為雙縮脲反應。 (堿性溶液 ) Cu2+ 紅紫色絡合物 180176。 C 雙縮脲反應 蛋白質在遠紫外光區 （ 200230nm）有較大的吸收 ， 在280nm有一特征吸收峰 ， 可利用這一特性對蛋白質進行定性定量鑒定 。 蛋白質質量濃度 /（ mg/ml） = 280 260 測定范圍： ～ (七 ) 蛋白質的含量測定 (自學 ) 考馬斯亮藍染色法、紫外吸收法、凱氏定氮法等 參見 p5556 本章總結 1. 蛋白質的分類。 蛋白質的功能 2. 蛋白質的組成（元素組成、化學組成）及蛋白質含量的測定 3. 20種氨基酸的 結構 、 分類 及名稱（ 三字縮寫符 、單字縮寫符） 4. 氨基酸的 重要理化性質 ：兩性解離、 茚三酮 顯色、與 2,4二硝基氟苯（ DNFB）反應、 與異硫氰酸苯酯（ PITC）的反應 5. 蛋白質的 一級結構 ：肽、肽鍵、活性多肽及一級結構的測定 6. 蛋白質的空間結構： 二級結構 單元（ ?螺旋、 ?折疊、 ?轉角、無規卷曲）、 三級與四級結構 （超二級結構、結構域、亞基）及結構與功能的關系 7. 蛋白質的性質：大分子性質、蛋白質分子量的測定（離心法、凝膠過濾法、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法）、 兩性電離 （等電點、電泳、離子交換）、 膠體性質、蛋白質沉淀 （可逆沉淀、不可逆沉淀）、 蛋白質變性 、紫外吸收及顏色反應 8. 蛋白質的分離、分析技術 課外作業 P6162思考題 ：