弱光脅迫下鈣對(duì)番茄葉片鈣組分和活性氧代謝的影響畢業(yè)論文-資料下載頁

　　

【正文】 驗(yàn)采用無土栽培技術(shù)，營養(yǎng)液中的鈣含量從 mmol / L 降低到 mmol / L。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 6 個(gè)星期內(nèi)果實(shí)和葉片出現(xiàn)明顯的缺鈣癥狀。葉綠素?zé)晒鈪?shù)，例如 Fm 和 Fv/Fm，葉綠素和生育酚的含量降到低于控制水平，超氧化物歧化酶活性降低。此外，丙二醛作為脂質(zhì)過氧化作用的降解產(chǎn)物在缺鈣的葉片中增加了。每周噴施 CaCl2 溶液減少了約 50%臍腐病的發(fā)生。此外，葉綠素?zé)晒鈪?shù) Fm 和 Fv / Fm 值以及葉綠素和生育酚的含量比缺鈣處理組所受的影響小。丙二醛生成速率無顯著差異。SOD 活性在 Ca2 + 處理過的葉子中較高，而 PO 活性在缺鈣葉片中較低。關(guān)鍵詞：活性氧；抗氧化劑；鈣缺乏；酶；EGTA 萃取鈣；番茄 lycopersicum；過氧化物酶；超氧化物歧化酶；水萃取鈣縮寫：ASA =抗壞血酸； ADJ.=佐劑； DHA =脫氫抗壞血酸； =干（重量） ； =鮮重； MDA =丙二醛。 PO =過氧化物酶； RWC =相對(duì)水含量； SOD =超氧化物歧化酶； 巴比妥= 2 硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)引言已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鈣可以參與植物逆境環(huán)境（Bush 1995, Webb et al. 1996, Braam et al. 1996）的各種反應(yīng)的調(diào)節(jié)。在各種脅迫下植物細(xì)胞的游離鈣水平通常增加，如風(fēng)脅迫或冷熱脅迫（Knight et al. 1991, 1992, 1996, Marschner 1993） 。熱應(yīng)激使番茄果實(shí)增加了約2倍的鈣含量（Garbaczewska et al. 1998） 。這些增長被認(rèn)為是一個(gè)自適應(yīng)信號(hào)以激活某些生化事件，提高植物適應(yīng)環(huán)境能力(Monroy et al. 1993, Monroy and Dhindsa 1995, Braam et al. 1996)。Ca 2+的受體蛋白鈣調(diào)蛋白和其他蛋白質(zhì)也被發(fā)現(xiàn)能參與環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)(Braam et al. 1996)。鈣離子在膜穩(wěn)定和酶的合成的調(diào)節(jié)中起著舉足輕重的作用，例如蛋白激酶或磷酸酶。而氧化過程擾動(dòng)這些進(jìn)程，導(dǎo)致了細(xì)胞和膜降解。另一方面，它已被證明，外源性應(yīng)用的鈣離子可以改善植物在環(huán)境脅迫下的生長。此外，鈣以果膠酸鈣的形式提高了細(xì)胞壁和植物組織的穩(wěn)定性。果膠酸鹽降解受多聚半乳糖醛酸酶的調(diào)節(jié)，明顯受高濃度鈣離子的抑制。因此，在鈣缺乏組織多聚半乳糖醛酸酶的活性增加(Marschner 1993)，缺鈣的典型癥狀是細(xì)胞壁解體和受影響的組織的崩潰，如葉柄和上部莖（Bussler 1963） 。先前的研究表明在各種植物物種，缺鈣導(dǎo)致不同植物的生理功能紊亂，例如番茄和辣椒中的臍腐病或蘋果的苦痘病的產(chǎn)生。微量鈣供應(yīng)后的反應(yīng)、參與其中的鈣調(diào)蛋 缺鈣對(duì)番茄抗氧化系統(tǒng)的影響2白或鈣周期的調(diào)控后的反應(yīng)還不清楚。在本研究中，我們通過外加鈣對(duì)番茄果實(shí)腐爛和番茄葉缺鈣癥狀的發(fā)病率進(jìn)行了調(diào)查。為了鈣離子更好地滲透到葉子和果實(shí)中，氯化鈣溶液中要加入輔助劑(Konno et al. 1984)。另外，鈣作為第二信使有重要的功能(Bussler 1963)，它在抗氧化防御系統(tǒng)中的作用，也是本研究的內(nèi)容。材料與方法植物材料和處理番茄的實(shí)驗(yàn)在波恩大學(xué)科研工作基地進(jìn)行，在 panovy 溫室中采用無土栽培技術(shù)。計(jì)算機(jī)控制灌溉和施肥，溫度和濕度分別調(diào)整為 23 177。 2℃/18 177。 2℃（晝/夜周期）和 65 177。 2％的相對(duì)濕度。用生物的方法控制害蟲。實(shí)驗(yàn)期間無殺菌劑的應(yīng)用。誘導(dǎo)缺鈣為了誘導(dǎo)臍腐病的發(fā)生，營養(yǎng)液中鈣含量從 mmol/L 的控制減少到 mmol/L來確保鈣源的不足。植物的處理使用CaCl 2?2H2O（Merck, reagent grade）決方案。表面活性劑是商業(yè)上準(zhǔn)備的以平均5個(gè)環(huán)氧乙烷（EO）為單位的菜籽油衍生物（甘油三酯聚氧乙烯醚） 。氯化鈣配方中的表面活性劑由波恩大學(xué)園藝系開發(fā)，其中含有蓖麻油，離子型和非離子表面活性劑。配方（佐劑）溶液中加入氯化鈣溶液的濃度為2g / L 。在研究中使用了以下的處理：：鈣離子的濃度為 。+佐劑。 3.（Ca）：減少鈣供應(yīng)，鈣在營養(yǎng)液中為 。4.（Ca+CaCl 2）：，氯化鈣，外源施用。5.（Ca+CaCl 2/adj）：+氯化鈣配方，外源施用。每周采用背負(fù)式噴霧器噴灑。 。生物療效評(píng)價(jià)栽培 10 周后果實(shí)成熟并收獲。對(duì)有臍腐病的與無臍腐病發(fā)病數(shù)統(tǒng)計(jì)評(píng)估。臍腐病的發(fā)病率用收獲果實(shí)的百分比表示。鈣含量分析隨機(jī)抽取出各處理組果實(shí)進(jìn)行鈣分析。為了去除葉和果實(shí)表面殘留鈣離子，用蒸餾水洗滌葉和果實(shí)兩次。果實(shí)和葉在冷凍干燥機(jī)干燥后，被研磨成細(xì)粉末，并根據(jù)Chen 等人用硝酸和過氧化氫將 g 干燥后的樣品溶解。水溶鈣用水提取，細(xì)胞壁或沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文外文翻譯3質(zhì)膜結(jié)合鈣用 EGTA 提取。用原子吸收光譜法（AAS ）測(cè)定鈣含量。葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量是一個(gè)很好的手段，尤其對(duì)逆境下的光合器官早期測(cè)量和詳細(xì)分析方面。將出現(xiàn)的癥狀番茄葉暗適應(yīng)30 min，使用pulseamplitudemodulation fluorometer（ PAM, model 2022, Walz, Effeltrich, Germany）測(cè)量（Fv / Fm值）和最大熒光（Fm） 。在約 25℃和大氣CO 2水平500–600 ppm條件下測(cè)定番茄葉片的葉綠素?zé)晒猓–F ） 。番茄葉被轉(zhuǎn)移到 CF測(cè)量室并暗適應(yīng)30 min。熒光測(cè)量在近軸葉表面進(jìn)行（1995） 。最初的葉暴露，以便確定對(duì)于一個(gè)峰值調(diào)制測(cè)量光束( –2 s–1)。隨后，葉片暴露到800 ms白光飽和脈沖中以評(píng)估 Fm值。 （FMFO ）/FM =Fv/Fm比值很方便地衡量一個(gè)給定樣本潛在的最大PSI量子產(chǎn)率 (Keutgen and Lenz 2022)。代謝產(chǎn)物分析和酶的檢測(cè)取樣番茄葉片早在由于缺鈣的首發(fā)癥狀變得可見時(shí)取樣（圖 1） 。樣品稱重，并凍結(jié)在80℃中。丙二醛釋放（TBA 反應(yīng)物質(zhì)）由于過氧化作用導(dǎo)致多不飽和脂肪酸的降解產(chǎn)生了過氧化氫離子，丙二醛，這個(gè)過程導(dǎo)致膜硬化和細(xì)胞死亡。因此，丙二醛（MDA ）的濃度變化，可以作為植物膜的結(jié)構(gòu)完整性的一個(gè)很好的指標(biāo)。丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用比色法完成，分別在532nm和非特異性吸光度590 nm處測(cè)定。為了增加特異性，TBA反應(yīng)的化合物通過反相高效液相色譜法被進(jìn)一步分離。在注射前，樣品的pH 值，酸緩沖液（pH ）調(diào)節(jié)。該方法的校準(zhǔn)用 1,1,3,3 四乙氧基，它是定量丙二醛分解反應(yīng)過程。對(duì)校準(zhǔn)樣品中的丙二醛（MDA）含量進(jìn)行了分光光度法分析(E 532 nm =155 mmol/L–1 cm–1)和高效液相色譜分析。色譜條件：HypersilODS柱，5μm（250 mm * 4 mm, 10 mm guard column） ，柱溫：30℃ ；流動(dòng)相： A5％（v/v）的醋酸，B甲醇；規(guī)劃的梯度：0 20min 從30％至85％的 B在A中，2030min，100％B，注射量20μL，流速1mL min–1；檢測(cè)532nm；丙二醛的保留時(shí)間： .。 葉提取物中的維生素 E /生育三烯酚譜Schmitz 和 Noga 通過高效液相色譜法測(cè)定維生素 E/生育三烯酚衍生物。該方法適用于各種生育酚和它們的衍生物的分離和鑒定。葉片研磨并用己烷/異丙醇萃取，色譜分離， Lichrospher 的 Si60 柱（5 μm, 4mm 250 mm） 。該生育酚/ 生育三烯酚的熒光信號(hào)在 285 nm 的激發(fā)波長和 320nm（發(fā)射波長）進(jìn)行檢測(cè)。α，β ，γ ，δ生育酚和 α 缺鈣對(duì)番茄抗氧化系統(tǒng)的影響4，β ， γ，δ生育三烯酚的基礎(chǔ)上，對(duì)其熒光光譜進(jìn)行了表征。熒光發(fā)射的純標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行定量測(cè)定（Merck） 。由于生育酚的穩(wěn)定性可能隨著 pH 值的升高而降低，提取過程的質(zhì)量檢查的樣品提取液中添加規(guī)定量的 α生育酚。α 生育酚的回收率為 93 177。 2％，并不受樣品中的生育酚含量的影響。葉提取物中的抗壞血酸含量的變化葉片研磨并用偏磷酸鉀緩沖液萃取。測(cè)定每個(gè)樣品的兩個(gè)等分試樣，一個(gè)樣品添加抗壞血酸過氧化物酶和另一個(gè)未加。由于抗壞血酸（AsA）是容易氧化的化合物，在樣品制備的開頭添加還原劑2,3 二羥基丁烷1,4 二硫醇（DTE）是很有必要的。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化程序（Anonym 1995）進(jìn)行了分析。葉綠素含量的測(cè)定葉片的葉綠素含量用二甲基亞砜（DMSO）將新鮮植物材料提取后用分光光度計(jì)測(cè)量。葉綠素 a 和葉綠素 b 提取液分別在 663nm 和 645nm 波長下測(cè)定。酶活性鮮切葉稱重，液氮冷凍，研磨成細(xì)粉末。因?yàn)槟承┟妇哂心そY(jié)合的同功酶形式，檢測(cè)需要進(jìn)行粗葉勻漿。分析提取物的抗氧化酶，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（PO） 。超氧化物歧化酶 （SOD）：用含有 HEPES/KOH（pH 為 ） ， mmol / L 的EDTA 緩沖液， 單位黃嘌呤氧化酶， mmol/L 的四氮唑和 4 mmol/L 的葉黃素的反應(yīng)混合物（1mL）中提取，并在 560 nm 處測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）的活性。濃度曲線計(jì)算建立(Giannopolitis and Ries 1977)。由于 SOD 是相對(duì)不穩(wěn)定的，所以樣品萃取液中要加入定量的超氧化物歧化酶。超氧化物歧化酶（SOD）的回收率為 84 177。 4％，樣品中 SOD 活性無明顯影響。過氧化物酶 （PO）：PO 活性的測(cè)定的試驗(yàn)混合物含有 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液（pH ） ， 20 mmol/L 的愈創(chuàng)木酚，50μL mmol/L 的過氧化氫和總體積為 3 mL 的提取液。測(cè)定其在 420 nm 處的光吸收的變化，隨后在 2022℃至確定PO 活性(Bufler and Bangerth 1982, Dai et al. 1997)。 PO 的回收率為 91 177。 3％。Bradford（1976）所述中，利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。回收率為 96 177。 2％。統(tǒng)計(jì)分析用統(tǒng)計(jì)程序statgraphics （Rockville, Maryland, USA）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。5％概率水平指示顯著差異。對(duì)正態(tài)分布和方差同質(zhì)性的數(shù)據(jù)進(jìn)行了測(cè)試。用 TukeyHSD 多重分析對(duì)鈣含量和植物成分的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，通過多重比較測(cè)試了臍腐病發(fā)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文外文翻譯5病率的數(shù)據(jù)（Kohler et al 1994） 。鈣含量和植物成分進(jìn)行了 8 個(gè)完全隨機(jī)重復(fù)測(cè)定。番茄試驗(yàn)設(shè)置了隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。各處理組包括 6 株植物和 4 次重復(fù)。每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取兩個(gè)果實(shí)進(jìn)行 Ca2+離子的測(cè)定。結(jié)果外源施鈣減少生理紊亂供應(yīng)濃度為 mmol/L 的 Ca2+溶液加重了臍腐病的發(fā)病率，其發(fā)病率為53％（圖 1A，B，圖 7） 。6 個(gè)星期內(nèi)果實(shí)和葉片發(fā)生明顯的缺鈣癥狀（圖 7，圖 8） 。和微量供給鈣的番茄植株相比，用背負(fù)式噴霧器噴施 CaCl2 溶液（ mmol/L 的鈣）番茄植株臍腐病的發(fā)病率減少至 44％。配制的氯化鈣溶液噴涂減少臍腐病發(fā)病率至 29％（圖 1 A，7） 。當(dāng)應(yīng)用鈣時(shí)，與劇烈減少臍腐病癥狀相反，番茄果實(shí)中的內(nèi)源性鈣含量沒有這么多的增加。和對(duì)照組果實(shí)相比，缺鈣組的果實(shí)鈣含量減少到 （圖 1B） ，而與微量鈣供應(yīng)組相比，應(yīng)用氯化鈣+ 佐劑導(dǎo)致內(nèi)源性鈣含量有微量增加。EGTA 萃取鈣的分析（圖 2）表明，對(duì)照組和對(duì)照+佐劑處理組鈣含量數(shù)值最高，而它們的缺鈣植株數(shù)最低。CaCl 2 溶液配方的噴霧應(yīng)用與Ca 處理組相比顯著的提高了EGTA 提取鈣分?jǐn)?shù)。在缺鈣組中水萃取鈣的量減少，而 CaCl2/adj 溶液的外源應(yīng)用提高了水萃取鈣的量到對(duì)照水平。EGTA 萃取鈣與番茄果實(shí)中臍腐病的發(fā)病率建立了高度的線性相關(guān)性(r 2 = )，而水萃取鈣與臍腐病的發(fā)病率的相關(guān)性系數(shù)為 r2 = （圖 2） 。原文出處:Michaela SchmitzEiberger*, Roland Haefs, Ge Noga Calcium deficiency – Influence on the antioxidative defense system in tomato plants Department of Horticulture, University of Bonn, Auf dem H252。gel 6, 53121 Bonn, Germany Received June 26, 2022 Accepted January 25, 2022 缺鈣對(duì)番茄抗氧化系統(tǒng)的影響6