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細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門-資料下載頁

2025-11-02 05:45本頁面

【導(dǎo)讀】毒過的物品）、包裝臺。必須放在無菌間的設(shè)備：離心機(jī)、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4℃冰箱。潔爾滅或者％過氧乙酸擦拭。：用75％酒精擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。75％酒精棉球擦凈雙手。，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。，防止交叉污染。、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持20-30分鐘。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。為了防止清洗器材已。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。

　　

【正文】盤天平平衡后，放入離心機(jī)中 3000r/min 離心 3min 五 .制備細(xì)胞懸液：。 10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。六 .細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度以 5105/ml 為宜。七 .培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì) 胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入 37℃ 和 5％ CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi) 24 小時(shí)（或者 2448 小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。初學(xué)者易犯錯(cuò)誤： 1 水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到 37℃ 。，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長。，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。細(xì)胞計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作：一 .準(zhǔn) 備工作：取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。二 .細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備方法是用％的胰蛋白酶液消化、 PBS 液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或 Hanks 液或 PBS 等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液。三 .細(xì)胞計(jì)數(shù)：：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。：用吸管吸 5 滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入 5 滴臺盼藍(lán)染液（％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有 16 個(gè)中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。 :按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)） /ml＝（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù) /4) 2104 說明：公式中除以 4 因?yàn)橛?jì)數(shù)了 4 個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以 2 因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是 1： 1 稀釋。公式中乘以 104 因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：（長）（寬）（高）＝而 1ml＝ 1000mm3 四 .細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104 個(gè) /ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確； 4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。 5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。五 .初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤： 1. 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。 2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。 3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。六 .本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制： 4％臺盼藍(lán)母液：稱取 4 克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至 100毫升，用濾紙過濾， 4℃ 保存。使用液：使用時(shí)，用 PBS 稀釋母液至％即可。細(xì)胞的凍存 4℃ 冰箱，約 40min。 20℃ 冰箱，約 3060min。 80 超低溫冰箱中放置過夜。。 5 同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。注意事項(xiàng)： DMSO 前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下， DMSO 對人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。 0℃ ～ 60℃ 這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū) 內(nèi)，是 “ 危險(xiǎn)溫區(qū) ” 。，及時(shí)添加。

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