基因工程的發展-資料下載頁

　　

【正文】 ） 抗性標記基因 （可直接用于選擇轉化子） 主要是 抗生素抗性基因 : Ampr ， Tetr ， Cmlr， Kanr， Strr 2） 生化標記基因其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如 lacZ常用的遺傳標記基因及其作用機制1)四環素抗性基因 （ Tetr， Tcr）Tetracycline可結合在核糖體 30s亞基中的一種蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。四環素抗性基因編碼一種 399AAs蛋白質，與細菌細胞膜結合， 阻止四環素分子進入 細菌細胞。2)氨芐青霉素抗性基因 （ Ampr， Apr）Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。 Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內酰胺環，使氨芐青霉素失活。3)氯霉素抗性基因 （ Cmlr， Cmr） Chlorophenicol可結合在核糖體 50S亞基上，阻止蛋白質合成。 Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素 乙酰化，導致乙酰化的氯霉素不能結合在核糖體上。4)卡那霉素 (Kanr),新霉素 (Neor)和 G418抗性 (G418r)基因Kanamycin， Neomycin和 G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。Kanr等 抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進入細胞內。5） β— 半乳糖苷酶基因（ lacZ和 lacZα）β— 半乳糖苷酶基因有 1021AAs，基因產物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質可分為兩部分： α鏈和 β鏈。前者負責四聚體裝配，后者具 β— 半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現出酶活性，該作用稱之為 α互補作用 。這兩個部分可獨立存在， 分別由兩個基因編碼。為 α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼 145AAs)。這兩個基因（ LacZ和 LacZα）均可作為標記基因。 lacZ（ lacZα）中含有多克隆位點，當無外源 DNA片段插入時，質粒表達 β— 半乳糖苷酶的 α肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼 α肽）表達的 lacZ基因產物（ β鏈）互補，產生有活性的 β— 半乳糖苷酶，在含有指示劑 Xgal和誘導劑 IPTG的存在下，菌落呈現蘭色；外源基因的插入后，破壞了 lacZα肽基因的結構，細菌內不能產生 β— 半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。β— 半乳糖苷酶基因的優點 :a.酶催化 XGal水解為蘭色產物，檢測直觀b.lacZα編碼 5‘端可容許很大的變化（如加入多克隆位點）而不影響酶活性c.lacZα和 β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大PLacZαLacZβ轉錄 翻譯 αβLacZ基因的結構與產物pUC18BamHI片段重組 DNA分子 轉化 外源 DNA BamHI片段 涂布在含 XGal和 Ap的平板上 ,白色菌落為重組子， 蘭色菌落 為原載體利用 LacZ基因篩選重組子（四）、質粒載體的類型根據載體的分子生物學特性劃分 （ 1） . 質粒型載體 — 環狀 dsDNA分子，自主復制 （ 2） . 病毒型載體 — 環狀、線狀、 ss和 dsDNA分子，形成病毒顆粒 （ 3） .混合型載體 — 具質粒和病毒特性，特性的轉換依賴于宿主細胞生物學特性 根據載體功能劃分（ 1） .普通型載體1)特點 :至少有一個以上的克隆位點和兩個標記基因，其中一 個用于轉化體選擇，另一個用于重組子檢測。2)用途 :基因組或 cDNA文庫的構建 。次克隆 (subcloning)或限制酶譜分析；外源 DNA擴增。例子 :pBR322和 pUC載體。上述兩例中的非重組子來源有兩個：a.酶切反應時仍未被作用的 pBR322或 pUC18分子 b. 酶切后的載體分子經自我連接又形成載體分子普通型載體 pBR322的結構圖pUC18和 pUC19載體（ 2）、表達型載體（ expressionvector）1)特點 :a.基因的啟動子序列和終止子序列；b.一般無檢測標記基因；c.克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；d.重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。2)結構 :a.轉化單元 宿主細胞轉化b.表達單元 外源基因表達3)類型 :Ⅰ 型 ：轉錄起始區（調控序列 +啟動子） +終止子Ⅱ 型 :轉錄起始區終止子 +翻譯起始區（核糖體結合序列和起始密碼子） +終止子Ⅲ 型 :轉錄起始區 +翻譯起始區 +信號肽鏈編碼區 +終止子（常稱之為表達分泌型載體）三種表達型載體結構圖顯然 ,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之 ,被表達的外源基因一旦確定 ,表達載體的類型也就確定了。4)用途 :a.表達外源基因以產生大量外源基因產物b.用于構建 cDNA文庫 四、常用質粒載體舉例 pBR322載體 pUC載體 pBR322載體優點：分子量較小，為 4363bp，不僅利于自身 DNA的純化，可容納的外源 DNA也較大。具有兩種抗菌素抗性基因可供轉化子的選擇記號。具有較高的拷貝數，經過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積 10003000個拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。BamHI片段 (Tcr)pBR322PstI(Apr)片段 重組分子 I 重組分子 Ⅱ (ApsTcr)(AprTcs）PstI片段 外源 DNABamHI片段重組分子 I涂布 Ap平板 Apr轉化子 分別轉化 (ApSTcS)重組分子 Ⅱ 涂布 Tc平板 Tcr轉化子影印到 Tc平板上 AprTcS為重組子AprTcr為原載體 影印到 Ap平板上 ApSTcr為重組子 即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程篩選重組子的示意圖 pUC18和 pUC19 pUC系列質粒載體具有三個顯著特點： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數（不用氯霉素擴增，每個細胞含 500700個拷貝）。 （ 2）、含易于檢測是否有外源 DNA插入的標記基因 LacZα ，可利用 ?互補原理進行藍白篩選。 （ 3）、多克隆位點區（ MCS） 由人工合成的多個單一酶切位點構成。每一種限制性內切酶會產生不同的粘性末端，可選用兩種內切酶組合在質粒載體和外源 DNA上產生相同的末端，進行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 其 MCS區與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉移到 M13mp載體，進行 DNA測序和體外突變等研究。pUC18和 pUC19載體利用菌落顏色篩選重組子分子克隆載體的選擇1.選擇克隆載體的幾個重要參數（ 1）實驗對象 （ 2）實驗性質（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點（ 5）載體的穩定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達產物產量、產物特點等2.實驗對象（ 1）供體：遺傳背景與 DNA特點等，其中包括染色體 DNA大小，基因大小與結構，堿基組成，目的基因的產物特點以及遺傳物質的傳遞方式等。（ 2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質的傳遞方式 (包括人為的方法 )， DNA限制修飾系統， DNA重組基因特點，基因產物修飾系統，即轉錄與翻譯后修飾系統。如常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如： DH DH5α 、 E .coliDH5αF’ 1） 三者均有限制 修飾系統和重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發生重組2） DH5α 和 DH5αF’ 都具有一個可供遺傳標記 lacZα 檢測的遺傳背景3） DH5αF’ 可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’ 的存在3.實驗性質分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構建基因文庫或 cDNA文庫 （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結構分析等 （ 5）基因表達與調控機理的研究1) 建立文庫用載體 常在 進行 小 — 質粒載體，操作方便，鑒定簡單 大 —λ 或 cos質粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫規模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補法：可表達 ,選一般載體 。不表達，選表達載體 (外源基因必須表達，表達產物必須具備活性 ) ⅱ) 免疫法：與上同，但表達產物不一定具生物活性 ⅲ) 雜交法：各種載體均可2) 目的基因的鑒定 次克隆：選用質粒載體，限制酶譜分析，基因結構分析等 定序：定序載體（ M13mp系列），其他質粒載體（如 pUC系列，pBR322， T3， T7， SP6啟動子載體）3) 基因表達與調控 外源基因可表達 — 普通載體 。 不表達 — 表達型（分泌）載體 4. 載體容量 M13mp載體 4 kb 細菌質粒載體 10kb λ 載體 23kb cos質粒載體 48kb P1載體 95 kb pYAC載體 ∽1000 kb5. 合適的克隆位點 單克隆位點和多克隆位點演講完畢，謝謝觀看！