分子生物學試驗的常見問題與解決方案以下所有都轉自胡老師的新浪-資料下載頁

　　

【正文】 NA的濃度呈正比。10.IPTG用于誘導lac、tac啟動子的轉錄，但其本身具有一定的毒性，若用于醫療目的的重組蛋白并不適合。該如何解決這一問題？答：有兩種解決方法：（1）把阻遏蛋白lacⅠ的溫度敏感突變株lacⅠ(ts)插入表達載體或整合到染色體后，均能使lac、tac啟動子的轉錄受到溫度嚴謹調控，在較低溫度（30℃）時抑制，在較高溫度（42℃）時開放；（2）用乳糖替代IPTG，但其效率受到多種因素的影響和制約，因此乳糖誘導的有效劑量大大高于IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖代替IPTG作為誘導劑的研究要與發酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。11.PL和PR表達載體由于菌體中沒有cI基因產物，PL或PR啟動子的高強度直接轉錄使其在普通大腸桿菌中相當不穩定。如何解決這一問題?答：辦法之一是用溶源化λ噬箘體的大腸桿菌作為PL和PR啟動子表達載體的宿主菌；或是把cI857ts基因組裝在表達載體上，這樣就可以有更大的宿主菌選擇范圍。？答：解決這一問題的辦法之一就是在表達系統中低水平表達T7溶菌酶基因。因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上的肽聚糖外，還與T7 RNA聚合酶結合抑制其轉錄活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉化質粒導入表達系統，它能明顯降低本底轉錄，但對誘導后目標基因的表達水平沒有明顯影響。13.去除附加的甲硫氨酸有什么方法？答：在表達系統中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因；分離純化后在體外用外肽酶處理。14.轉化的大腸桿菌為什么不長？答：A）檢查感受態細胞是否有問題，不管公司的也好自己做的也好，轉化連接產物時同時轉化一只質粒，作為對照。B）連接T的時候,保證連接比例沒有問題。連接時間可以適當延長，但是試劑盒的連接往往效率很高，連接時間不是大問題。C）轉化的細節處理：加培養基復蘇：搖1h的話，可以多加入一些培養基，此時培養基一定不要加入抗性！搖1h復蘇，搖速在150rpm先搖30min。D)涂板時來回輕輕涂布，感覺大多數地方都涂到即可,不要反復用力涂布,不要把涂布環或者涂布棒燒的過熱,或者不待冷卻就涂。切記感受態細胞比較嬌嫩。E）檢查一下瓊脂板是否有問題。F）檢查一下抗生素在配置過程中是否出錯，有沒有加錯。15.如何增加蛋白在大腸桿菌中的表達？答：有以下幾種方法：（1）摸索不同溫度進行表達（2）提高誘導時間（3）改變基因上游構建，對目的基因進行密碼子優化（4）提高質粒穩定性（5）插入信號肽16.提高目標蛋白的穩定性的措施有哪些？答：主要有：（1）利用蛋白轉運系統把目標蛋白最終積累在周質空間或分泌到培養基中；（2）采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；（3）對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯聚合表達；（4）共表達能提高特定目標蛋白穩定性的輔助因子，如分子伴侶基因；（5）對蛋白質序列中的蛋白水解酶敏感區域和識別位點進行改造；（6）在較低溫度下培養菌體和優化發酵條件。bbsbio20090722 10:01Southern雜交（1）做Southern用雜交袋還是雜交管（瓶）好？答：雜交管好用，首先雜交管不用擔心氣泡問題，而且膜可以均勻雜交，其次雜交管其實也用不了多少雜交液，只需要幾毫升，在雜交爐里旋轉就可以保證膜均勻雜交。（2）細菌基因組酶切后的條帶可不可以用非變性聚丙烯酰胺凝膠來分離？然后再通過濕轉印到尼龍膜上，一般要轉印多久？%左右的瓊脂糖凝膠來分離的，但是通過傳統的毛細管法轉印到膜上比較麻煩，瓊脂糖凝膠上的DNA能通過半干轉印儀來轉印嗎？答：首先不一定要用非變性聚丙烯酰胺凝膠來分離：Southern雜交目的就是要知道基因組中是否有想要的基因片段，并且可能還要知道此基因片段的位置是否與預期的一樣，所以酶切基因組并雜交，其雜交條帶的大小是很重要的指標，如果采用非變性聚丙烯酰胺凝膠，雖然大多數DNA的遷移率與其大小的對數值成反比，但遷移率也受堿基組成序列的影響，以致大小完全相同的DNA遷移率相差達10%，所以非變性聚丙烯酰胺凝膠不能用來確定DNA的大小。一般采用瓊脂糖凝膠電泳。但是，如果不在意片段的大小，可以聚丙烯酰胺凝膠后采用電轉的方法。電轉的時間取決于片段的大小，凝膠空隙和外加電場的強度，可參閱電轉移的說明書。其次是轉移方法：基本上有三種：毛細管轉移最常用也很穩定。電轉移效果不好，必須使用帶電的尼龍膜，溫度可能會過熱等等問題，經常是時而轉不出來。真空轉移效率?擼枰瞧鰲Ｃ腹蘢撲淙宦櫸?，但脫]刑跫那榭魷倫詈糜?，而且窚\Ｎ榷ǎ笮∑味寄蘢煤芎謾?（3）Southern雜交的時候用什么來做標記比較好呢?除了放射性元素以外。答： 非放射性標記系統主要包括三大類：半抗原類、熒光色素類、酶類。其中半抗原類使用最為廣泛，商品化選擇最多。①半抗原類：主要有生物素(biotin)、地高辛、熒光素、二硝基苯(dinitrophenyl)、雌二醇、香豆素等，前三者使用最為廣泛，且均有商品化試劑盒選用。②熒光色素類：主要包括熒光素、異硫氰酸熒光素、香豆素、德州紅等。③酶標法：以Amersham Pharmacia公司開發的ECL系統為代表。它是在戊二醛的作用下將辣跟過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)與寡棱苷酸探針片斷直接共價相連，此法簡化了檢測步驟，減少了非特異污染的可能。在這些系統中以新的熒光色素類標記物最具潛力。非放射性系統的優勢為：(1)安全、無污染、使用及后處理方便；(2)穩定性好，標記好的探針可保存一年甚至更久，降低工作強度、批次檢測之間重復性好，為多樣本或長期檢測帶來極大方便；(3)利用幾種不同的探針標記方法，可一次對同一樣本進行多探針雜交。非放射性標記物發展方向為靈敏度高、穩定性好、實驗周期短、檢測方法簡單、安全。細菌的藍白斑篩選法篩選轉化子?。?）藍白斑篩選怎么都是白斑？目的基因900bp，T載體是takara的PMD18－T，加A后與T載體連接。瓊脂平板表面涂40微升2％的X－gal和28微升5％的IPTG，16h后平板上都是白色菌落，一個藍色的也沒有。選了5個菌落，搖過夜，抽提質粒，電泳發現其中四個在2200bp左右有明亮的條帶。但載體就有2800bp左右，連上就應該有3700bp，那條帶是什么？答：如果平板上長了幾百個菌，全是白的就可能有問題，16h對常用的克隆用的大腸桿菌來說，因該已經顯色了，不過如果菌長得慢，比較小的話，可以在室溫或4度（３７度放久了容易長衛星小菌落），繼續放一段時間，看看會不會有部分變藍。如果就幾個或幾十個菌，白斑居多的可能性會有很大，但基本沒有連一個藍斑都沒有的情況，因為即使Ｔ載體不連接片斷，也有的會長出來（僅用Ｔ載體加連接酶后轉化，涂板，能長幾百個菌，也只是有幾個或是幾個是白的，說明不插入片斷并不一定都是藍的），這可能是由于Ｔ載體的質量也不是絕對的好，可能有部分發生了末端的降解，或者加Ｔ的時候不完美。另外，形成白斑的可能有兩種：①插入片斷破壞了半乳糖苷酶基因的讀碼框；②插入片斷雖然不破壞讀碼框，但插入片斷基因編碼氨基酸阻礙了半乳糖苷酶正確構象的形成?！?。若是帶了marker，才進行比較的，新提的質粒中一般占主要，亮度較大，在最前面。接著會有第二條帶，是線性的，第三條帶，是有缺口的。質粒直接比大小，與marker比，不好反應出其真實的大小。可以這樣比較：①比較提的質粒的超螺旋帶或線性的或缺口的。先從中找出較大的，大的可能性比較大；②質粒單酶切后，與marker比大小，或用質粒三條帶中的線性的與marker比大?。虎壑苯佑妹盖?，看是否放出與你目的基因片斷大小一致的片斷。takara的PMD18－T載體假陽性也就是白斑往往比較多，所以藍白斑只是參考作用，可以直接挑克隆篩選。一次挑20－40個克隆，然后直接取上清1－2ul作為模板進行PCR鑒定（注意要用載體上的通用引物進行鑒定），這樣就不用擴大培養抽質粒，節約時間和試劑。其實18T本來作藍白斑篩選效果就不太好,可以改用19T或者20T，效果可能好點。(2)為什么藍白斑篩選會出現假陰性？答：此類載體攜帶lacZ’基因，它編碼β半乳糖苷酶的N末端（α肽），并且處于可被安慰誘導物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，與乳糖結構類似但不能被β半乳糖苷酶降解）誘導的啟動子調控之下。質粒轉化的宿主菌為LacZ△M15 基因型（含有編碼N末端缺陷型的β半乳糖苷酶多肽的基因）。未重組的質粒轉化宿主菌后，在IPTG 的誘導下，質粒與基因組分別表達缺陷但可以相互補償的兩個肽（即α互補），形成了有功能的β半乳糖苷酶，該酶能把培養基中無色的Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深藍色的5溴4氯靛藍。然而當外源DNA 插入質粒位于α肽編碼序列中的多克隆位點時，由于破壞了α肽的閱讀框架，因而不能表達出與宿主菌基因組表達的缺陷型β半乳糖苷酶多肽發生α互補。由于沒有β半乳糖苷酶的酶解作用，致使重組菌形成白色菌落。由此，可以借助藍白斑很容易篩選出重組子。不過實際操作中發現當插入小片段時，重組子也有形成淺藍斑的情況。即藍色菌斑也有可能含外源基因。據最新報道，大概有30%的假陰性。（3）做藍白斑篩選重組子的時候，平板在37℃培養了16個小時，放入4℃下充分顯色3個小時，仍然只有白斑而沒有藍斑。在挑了菌落之后放入4℃冰箱內12個小時仍然沒有藍斑。但是再將其置入37℃條件下12個小時就出現了藍白斑？答：原因有可能以下幾個：首先可能是連接效率很高，片段全插進去了，還有可能是在AT克隆時插入了很多非特意性的片段，尤其是小的非特意性片段；這兩個情況幾乎看不到藍菌。另外底物有問題，用IPTG/Xgal或其他的，要注意加入的量，過大和過小都不行，另外這兩個配制的方法也不能錯。還有插入的片段很大，因為大片段插入后細菌生長的速度很慢，而且又是單拷貝的，所以就培養24小時才能明顯看出顏色。（4）藍白篩選在實驗操作過程中會發現有淺藍色重組子的出現，怎么解釋這種現象？答：如果培養時間過長，白斑也有可能變藍的。所以一般48小時就可以了。建議挑白斑搖菌后，再做一次篩選。外源基因在大腸桿菌中的表達（1）大腸桿菌構建基因工程菌，怎樣突破專利中的代謝途徑？要構建大腸桿菌構建基因工程菌，但國外已經幾乎把通向目標產物的所有途徑和相應的酶基因申請專利。能夠利用已有途徑，對其中的酶進行突變，這樣能突破專利嗎？答：一些基因是可以的，但是突變后的性質要發生很大改變，或者在序列上發生很大的差異，同源性一般要低于80％。國外的專利有些很霸道的，連可能的突變位置都申請了專利保護，這類基因很難突破專利的。（2）鄰近基因的表達相互是否有聯系??？比如幾個基因排列都處于相同的染色體區域，那這幾個基因的表達調控有否影響？答：不一定。在原核生物中，一個調控單位稱操縱子（如乳糖操縱子），乳糖操縱子包括調節基因、啟動基因、操縱基因和結構基因，這四個相鄰基因間的表達就相互影響，其中結構基因又包括表達三中蛋白的lacZ Y A三種基因，他們雖相鄰，但相互之間沒影響，共同受調節基因的表達影響。在相同染色體區域，不同操縱子之間一般不會相互影響。在真核生物中即使是染色體在同一區域的基因之間表達也可能不會相互影響。真核生物基因由外顯子和內含子構成，比方說用ABCDEF表示一段DNA，一個基因表達出來可能是ACD序列蛋白，另一個基因表達出來可能是BCE，在這段染色體中這兩個基因不僅是相鄰，還有部分重疊，他們之間的表達也大多不會影響，只不過是他們的表達受控于不同的調控序列或不同的啟動子。（3）什么類型的真核基因不適宜在大腸桿菌中表達？目前知道一些跨膜蛋白因結構太復雜，不能在大腸桿菌中表達，不知道一些糖蛋白基因能否在大腸桿菌中表達？答：在大腸桿菌中表達的蛋白不能夠被糖基化，所以如果糖基對于該糖基化蛋白的活性很重要的化，就不能夠用大腸桿菌表達。