基因工程原理-預(yù)覽頁

　

【正文】 .CCCGC（五）、 1.限制酶（物理）圖譜繪制1.2.酶切圖譜的構(gòu)建（ a）請構(gòu)建該環(huán)狀DNA分子的酶切圖譜酶切圖譜的構(gòu)建（ b）二、 DNA甲基化 酶（ 一）、 在 DNA重組實(shí)驗(yàn)中，常用的甲基化酶屬于 II型，它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶作用位點(diǎn)可同可不同。EcoRIAATTC相同2.GGATmCC— BamHI(G?GATCC)GAmATTC— EcoRI(G?AATTC)２） b.BamHI（ GGATmCC） MepI（ mCCGG）３） M． TaqI（ TCGmA） HindII（ GTPyPuAC）：GTCAAC， GTTAAC， GTCGmAC， GTTGAC3.來自于 ，分子量 28,000外切酶活性： 3’→ 5’，產(chǎn)生 5’單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 核酸酶 H活性：除去 DNARNA雜交分子中的RNA分子， pH4)反應(yīng)底物：互補(bǔ) dsDNA2)4.1)核酸（ DNA）標(biāo)記5.斷口缺口 (gap)斷口 (cut)339。 339。539。P539。HO339。HO339。OH339。P539。339。RNaseHExoIII的外切酶和 RNaseH的作用13ac 13ac13ac13ac13ac3ac4bacExoIII用于順序缺失539。339。大部分用于 RNA的核苷酸序列分析或除去 DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的 RNA分子。核酸酶 S7， 亦稱微球菌核酸酶，對 RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源 mRNA作用于 DNARNA雜交分子中的 RNA鏈，用于 cDNA文庫建立時(shí)除去 RNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成。I1.Ca2+或 Ca2+DNA分子上將形成切口，不同類型二價(jià)陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響： Mg2.2)Mn++存在時(shí) 3’5’I四、 DNA聚合酶（一）、 DNA聚合酶 I（ polI）具 3’→5’ 外切酶活性IIIpolI的特點(diǎn) 1）具兩種外切酶活性和 DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個(gè)大小不同的片段，其中小片段具 5’ →3 ’ 外切酶活性，大片段具 3’→5’ 外切酶活性 (大片段亦稱為 Klenow片段 ,要求 3’ OH引物和模板 DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響3.其中用途 2)DNA聚合酶I的兩倍 4000nt/min聚合酶活性 dNTP（三）、 Taq對 95℃ 高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→ 5’外切酶活性2.→ 5’5’引物 3’5’5’5’DNA連接酶用途：1)平整末端的相連限制酶與其它酶共同作用結(jié)果 5’AOHAOH3’TTCGAA5’TTCGAPAHOPAGCTAHOPAGCTT4AAGCTT3’T4質(zhì)粒 DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。 根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為 15個(gè)）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá) 10200份拷貝）。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。1.pCR,et （二）載體特點(diǎn) （三）遺傳標(biāo)記基因 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進(jìn)入宿主細(xì)胞這種指示可以是選擇性的（ Ampr這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性的（如 TcS， 有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（ lacZ等）。TetrAAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合， 阻止四環(huán)素分子進(jìn)入 細(xì)菌細(xì)胞。氨芐青霉素抗性基因 （ Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。CmlrS亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。新霉素 (Neor)和 G418抗性 (G418r)基因5） β— 半乳糖苷酶基因（ lacZAAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。分別由兩個(gè)基因編碼。 lacZ（ lacZα）中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)無外源 DNA片段插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá) β— 半乳糖苷酶的 α肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼 α肽）表達(dá)的 lacZ基因產(chǎn)物（ lacZα編碼 5‘端可容許很大的變化（如加入多克隆位點(diǎn)）而不影響酶活性 病毒型載體 — 環(huán)狀、線狀、 ss和 dsDNA分子，形成病毒顆粒 （ 3） .混合型載體 — 具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細(xì)胞生物學(xué)特性 根據(jù)載體功能劃分（ 1） .1)用途 :酶切反應(yīng)時(shí)仍未被作用的 pBR322或 pUC18分子 b. 酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子普通型載體 pBR322的結(jié)構(gòu)圖pUC18和 pUC19載體（ 2）、表達(dá)型載體（ expression1)b.克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動子序列后）；a.Ⅰ 型 ：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列 +啟動子） +轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子 Ⅲ 型 :+顯然 ,a.用于構(gòu)建 cDNA文庫 Tcr)(AprTcS)AprTcr為重組子 （ 3）、多克隆位點(diǎn)區(qū)（ MCS） 由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)（ 1）實(shí)驗(yàn)對象 （ 2）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點(diǎn)（ 5）載體的穩(wěn)定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等2.如： DH DH5α 、 E .coliDH5αF’ 1） 實(shí)驗(yàn)性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構(gòu)建基因文庫或 cDNA文庫 （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 （ 5）基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)理的研究1) 建立文庫用載體 常在 進(jìn)行 小 — 質(zhì)粒載體，操作方便，鑒定簡單 大 —λ 或 cos質(zhì)粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫規(guī)模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補(bǔ)法：可表達(dá) ,選一般載體 。 合適的克隆位點(diǎn) 單克隆位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。2023雨中黃葉樹，燈下白頭人。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211故人江海別，幾度隔山川。20231乍見翻疑夢，相悲各問年。 11 。11,March下午 20:43:42三月 21沒有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。2023很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211世間成事，不求其絕對圓滿，留一份不足，可得無限完美。20231不知香積寺，數(shù)里入云峰。 11 。11,March下午 20:43:42三月 21楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。2023閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。20231知人者智，自知者明。20231意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。下午 20:43:42三月 211最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。11,March下午 20:43:42三月 21MOMODAsitelit.blandit,fringillatempor感謝您的下載觀看專 家告 訴